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尼康顯微鏡的熒光激發塊

2014-07-13  發布者:admin 

 在這裏AG亚游集团展示如何激發塊選擇的平場免疫熒光顯微鏡可以擴展他們的能力。

平場免疫熒光顯微鏡是什麽

熒光團

熒光現象發生時由一種物質,當它釋放能量,當它從興奮狀態返回到其基態時就會發出亮光吸收特定波長的光 (勵磁光)。許多熒光物質 (稱為熒光團) 已經有不同的用途,與激發波長從紫外到紅外。然而,發射波長通常比的長的激發能量,使得它們的波長。

平場免疫熒光顯微鏡

平場免疫熒光顯微術指的是旨在觀察上述熒光團的顯微鏡。光學係統包含一個光源為勵磁 (通常汞燈) 和一個激發塊來分開熒光激發光。有許多激發塊供不同種類的熒光團,可能會切換為連續查看標本沾有多種類型的熒光團的任何時間。

平場免疫熒光顯微鏡中的激發塊中的作用

Figure 1

如圖 1 所示,2 種類型的激發快和 1 二色鏡的構建激發塊。選擇適當的激發塊和每次使用鏡子使得研究人員能夠達到一個高的信號信噪比 (S/N) 比之間的熒光和背景光。下文介紹了這些光學元件的功能。

勵磁激發塊 (EX)

Figure 2

勵磁激發塊是將隻有激發光所需的波長從激發光源 (通常汞燈) 傳遞到熒光基團的光元素。如圖 2 所示,隻有激發波長通過激發塊,通常"帶通激發塊"。

二色鏡 (DM)

Figure 3

二色鏡是分開的熒光激發光光學元件。二色鏡是光的特殊的鏡子,反映隻有一個特定波長,允許所有其他波長的光線通過 (圖 3)。在平場免疫熒光顯微鏡激發塊中使用的分色鏡放置在 45 ° 入射角,輕,創建一個"停止帶"的"及格樂隊"的傳輸的光和反射的光。光通過勵磁激發塊被反映 90 ° 朝著這一目標和標本。最後,從試樣所產生的光是通過傳遞和朝向觀察者 (或高靈敏度相機)。

屏障激發塊 (BA) 或排放 (EM) 的激發塊

Figure 4

障礙激發塊分離產生的從其他背景光熒光的熒光的光學元件。如圖 4 所示,屏障激發塊傳輸阻塞所有其他輕微泄漏從 (反映從標本或光學元件) 的激勵燈同時穿過二色鏡熒光波長的光。這是必要的因為熒光光的強度是比超過 100,光靠一個因素的激勵弱 000:1。大多數障礙激發塊被放置在一個小的角度,以允許更好的熒光成像通過抑製鬼魂形象。

尼康的噪音終結者

Figure 5

尼康的平場免疫熒光顯微鏡都有一種專有的稱為"噪音終結者"的尼康光學元件 (模型 TE2000 及更高版本)。如圖 1 所示,噪音終結者允許高效加工的光通過二色鏡傳輸通過防止光線從激發塊內散射和漏入的觀測圖像激發。這有助於消除背景光噪聲和更有效的熒光圖像。

選擇熒光激發塊和鏡

選擇熒光激發塊和鏡子時,應遵循以下步驟。

(熒光物質) 熒光波長

確定在使用熒光的波長。此信息指出在目錄裏,但熒光的波長特性也略有改變不同鹽度、 ph 值和胞內條件等的可解條件。因此,AG亚游集团建議用熒光計測量勵磁和熒光波長。然後,使用此信息來選擇最適當的光學元件。

二色鏡的選擇

Figure 6

所選色鏡必須有效分離激發光和熒光光的波長。具體而言,其透光率截止位於 fluophore 的激發波長和其熒光波長之間二色鏡必須通過比較鏡子的特性曲線與熒光的波長,鏡子放在 45 ° 入射角時發現。
如果 fluophore 的激發波長和其熒光波長關係密切,斯托克城的轉變 (注 1) 是小,然後應選擇鏡像與更小的截止波長,讓盡可能多的熒光信號,通過盡可能。

障礙激發塊選擇

選擇一個激發塊,允許熒光波長從傳遞的標本。通常情況下,長時間傳輸波長長的通激發塊都是選擇帶通激發塊。然而,是不會傳染這些波長較長的帶通激發塊是經常用作屏障激發塊從一個多重染色標本中分離的波長或使用相機對較長的波長敏感時。

勵磁激發塊選擇

Figure 7

選擇一個激發塊,允許激發波長下,順利通過。尤其是當汞燈用作光源,有效的激勵被通過線譜的汞燈納入波長。允許之外的目標熒光傳遞激發波長的波長將既增加背景光和損害標本。如圖 7 所示,激勵效率較低的波長為 440 牛米。

組合的屏障激發塊和勵磁激發塊

障礙激發塊和激發塊勵磁的完美結合是一個可以讓沒有光通結合時。發射的熒光是很弱,所以通過激發塊泄漏任何光線會降低圖像質量。

獲得明亮的熒光圖像

有時它被建議刪除 ND激發塊在勵磁光學和增加激發光源的強度。然而,增加激發光源的強度將會快速漂白熒光基團,損害的標本,以及日益增加的自體熒光 (注 2) 的單元格中。基於這些原因,光源應保持盡可能弱和觀察光學作出盡可能高效在撿的熒光信號 (通過擴大物鏡的孔徑,增加波段內熒光濾光片,使用更加靈敏的照相機等)。。

  • [注 1]斯托克城的轉變是指激發能量和熒光能量所產生的能量部分損失作為熱作為電子落回從興奮狀態中熒光材料其基態之間的能量差。(從岩波書店書店的物理和化學詞典)
  • [注 2]自體熒光是指在非那些通常被定義為熒光物質的熒光物質的存在。例如,單元組件 (如 NAADPH 或核黃素給掉在短波長範圍內 (紫外和可見) 在不染色細胞相對較強的熒光。

還原漂白工藝

你可以采取以下步驟,以減少漂白。

使用抗漂白的代理

P-苯二胺抗漂白劑可以用於 FITC 和 n-丙基 gallete 可以用於羅丹明。

使用 ND 濾鏡

使用中性密度或 ND 濾鏡上顯微鏡以減少光的水平到最起碼的觀察。有時這可能需要設置的篩選到 100%,同時考慮不分割的光路步驟盡可能多。

使用漂白耐熒光

為每個測試的目的使用可用的最耐漂白劑熒光。



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