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奧林巴斯顯微鏡的鈣離子探針

2014-07-31  發布者:admin 

 Cameleons 是一類新的活細胞,結果在熒光共振能量轉移 (煩惱) 在鈣離子存在下的構象變化通過運作中的鈣離子濃度的指標。在過去,熒光探針 Fura 2、 印-1 和熒光 3 等都非常受歡迎的測量活細胞內鈣離子濃度的波動。1997 年,博士淳脅 (瓦科、 日本理研腦科學研究所) 的開發一種新型鈣離子測量探針。這種探頭由人工種蛋白質組成從綠色熒光蛋白 (GFP),修改,和一名叫Cameleon (變色龍爬蟲類,但從名稱中刪除"h")。Cameleon 分子結構被建模為一種融合產品 (具有不同的激發和發射特性) 的兩種熒光蛋白質、 鈣調蛋白 (CaM) 和鈣調素結合域的肌球蛋白輕鏈激酶 (M13) 之間。鈣調素是綁定與遊離鈣離子的能力,它已綁定的鈣離子後,M13 鏈可以綁定與鈣調素。這些四種蛋白的基因都線性,加入並融合基因表達的各種各樣的細胞。

Cameleon 嵌合體為是卓越在基因工程和苦惱,生物物理技術測量兩個間隔緊密的分子之間的距離中的實際應用。一對為 FRET熒光蛋白被選擇他們的特征吸收和發射譜。一個熒光基團 (捐助者) 的激發能量轉移到另一個 (受體) 的磁偶極相互作用,沒有捐助熒光發射。捐助者排放和受體吸收譜必須為 FRET 發生重疊。此外,能量轉移發生隻有當兩個熒光分子內的每個其他幾個納米。對熒光蛋白,特別是一青色和黃色或藍色和綠色的 (CFP/YFP 和 BFP/GFP) 對一般選擇為 FRET 實驗由於其光譜特性。

Cameleon 分子由四個域 (見圖 1)。熒光蛋白加入在彼此在鈣離子,沒有這兩個端站,但在鈣離子存在下凸輪激活鏈接器環繞的 M13 蛋白質。Cameleon 嵌合體的三級結構然後改變,使兩個熒光蛋白化合物與能量傳遞的範圍。在低鈣濃度環境中,cameleon 分子是展開和 CFP 熒光時發生分子興奮與 442 納米的光。然而,當鈣離子濃度增加時,CFP 熒光減少和 YFP 熒光增加由於共振能量轉移。

綁定的鈣的鈣調素基團的 cameleon 生產在整個分子,空間接近的位置的兩個熒光蛋白的構象變化。這種構象,偶極能量轉移由興奮的 CFP 蛋白刺激 YFP 產生次生熒光在 530 納米。Cameleon 設計代表第一次的基因編碼的鈣傳感器,並提供機會,在一種相對的非侵入性的方式監測細胞的結構和生理動力學。細胞內鈣離子濃度可以通過熒光比例成像中的兩種類型的 cameleon 分子胞內鈣離子濃度變化的比率確定。當 cameleon 分子已被興奮在 442 的納米 (使用從氦鎘激光線) 時,可以在使用激光共聚焦掃描顯微鏡的 485 和 530 納米同時檢測其熒光。

在圖 2 中,提出了一種由 cameleon 監測實驗一典型的鈣離子。在這個實驗中,cameleon 嵌合體是類似於上文所述的 CFP/YFP 變體。這兩個基因都在 HeLa 細胞轉染脂技術同時表達。在圖 2 (a),說明鈣水平沒有興奮劑或鎮靜劑的存在。由 0.1 毫組胺刺激產生急劇增加鈣離子濃度的 (圖 2(b))),同時增加了 0.1 毫賽庚啶引出的拮抗作用 (結果中的鈣水平降低的圖 2(c))。



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