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奧林巴斯顯微鏡聲光可調諧濾波器(AOTFs)

2014-08-21  發布者:admin 

  光電技術在激光共聚焦顯微鏡的整合提供了一個顯著增強的光譜控製適用於各種各樣的熒光研究。 聲光可調諧濾波器( OTF)是一種光學裝置的功能作為一個電子可調諧激發濾光片同時調節強度和從一個或多個源的多波長激光線。 這種類型的設備,依靠專業的雙折射晶體的光學特性的變化的相互作用時的聲波。 在聲波頻率的變化改變了晶體的衍射特性,能夠非常快速的波長調諧,隻有聲運輸時間在水晶有限公司。

聲光可調諧濾波器設計的顯微鏡通常由一個二氧化碲或石英晶體的壓電換能器結合。 響應於振蕩射頻應用( 射頻 )電氣信號,變頻器產生的高頻振動(聲波)波傳播到的晶體。 交變超聲聲波引起的折射率的周期性分布通過晶體作為透射衍射光柵或布拉格diffracter偏離入射光的一部分轉化為一階光束,它是利用顯微鏡(或二階梁當入射光非偏振光;見圖1)。 改變施加到晶體傳感器信號的頻率改變折射率的變化,周期,因此,光的波長,衍射。 衍射光束的相對強度的振幅決定(功率)應用於晶體的信號。

在傳統的熒光顯微鏡的配置,包括許多共焦係統,光譜的激發和發射光的濾波是通過利用薄膜幹涉濾光片。 這些過濾器是在幾個方麵的限製。 因為每個過濾器具有固定的中心波長和通帶,幾個過濾器必須被用來提供多光譜成像單色照明,以及衰減的強度控製的光束,和過濾器通常是由一個旋轉炮塔機械互換機製。 幹涉濾光片炮塔和車輪的有限波長的選擇,振動速度較慢的缺點,開關,和潛在的形象轉換。 他們也很容易損壞的熱暴露,引起濕度,和強烈的照明,其光譜特性隨時間變化。 此外,過濾器輪利用照明波長的選擇變得日益複雜和昂貴的激光被雇用人數與當前的應用增加了。

旋轉的濾光輪和光學塊炮塔介紹機械振動轉換成的成像和照明係統,因此需要大概50毫秒的阻尼時間延遲,即使濾波器過渡本身可以更迅速。 典型的過濾器更換時間大大慢於實踐,然而,範圍在0.1到0.5秒。 在旋轉機構的機械不精確配準誤差時,可以引入順序獲取的彩色圖像進行處理。 此外,固定的頻譜特性的幹擾過濾器不允許不同的熒光團的組合優化,也不適應新的熒光染料,限製的激發和檢測的顯微鏡功能的通用性。 的聲光可調諧濾波器,共焦係統介紹克服的濾光輪缺點使快速電子調諧和從幾個激光器多條激光線的強度控製。

AOTF操作的基本原理

聲光晶體被定義為是聲波的存在改變的光學特性。 當聲波傳播通過這樣的材料,晶格結構交替壓縮和響應於振蕩波前放鬆。 負責本聲光互作用的基本機製是眾所周知的 光彈 功效 在整個晶體的晶格壓縮和稀疏的區域,表現為周期性的折射率的波動可以產生入射光的衍射。 雖然聲光可調諧濾波器的功能類似於一個衍射光柵,它的行為是不同的,發生在一個擴展的衍射晶體的體積而不是在一個平麵上,隻有有限的頻帶的光譜頻率的影響。 在這方麵,AOTF執行更多的作為一個帶通濾波器比衍射光柵。 傳播的聲波產生的整個晶體的折射率的周期性調製,有效地產生一個移動的相位光柵,將部分的入射光,滿足適當的相位匹配衍射(或動量匹配)條件。 對於一個特定的聲波頻率,隻有一個有限的範圍內(帶)的光譜頻率滿足相位匹配條件,並成為衍射。 不同的射頻驅動壓電換能器的變化的光譜通帶的中心,所需保持的相位匹配條件。 選擇適當的驅動頻率可以被調諧到不同的晶體衍射的特定波長帶,然後退出晶體在相對一個獨特的角度對衍射光束。

衍射波長(S)作為一種應用於晶體無線電頻率信號的功能變化。 對於一組特定的AOTF設計參數(包括晶體材料和幾何),中心波長( λ )的通帶是由相位匹配確定(和動量匹配條件由以下方程定義):

λcenter = V • Δn/f

在前麵的方程, V 是聲波速度, Δn 具有聲光晶體的雙折射,和 F 是聲波頻率。 光波衍射光束傳輸的振幅是應用於晶體的射頻功率成比例的。 因此,不同的RF信號的頻率和功率提供了一種機製,用於選擇光的AOTF濾波波長和強度。

在配置中的相互作用的聲學和光學波的初始AOTF設計中心 共線 ,如圖2所示。 在本設計中,聲波發射沿晶體的主軸線,與入射光束通過偏振器和沿晶軸相同的傳播路徑,與聲波共線相互作用(圖2)。 光譜波長的窄帶光為偏振方向的入射光束正交的,並且可以通過輸出偏振器從耦合共線光束分離( 分析儀分光器 圖2)。 如前所述,通帶的中心波長的相位匹配條件,存在光和射頻信號頻率之間的確定。

的共線AOTF幾何限製使用一個類的有限的晶體,而不幸的是,不包括一些最有效的聲光材料。 為了充分利用的好處,如二氧化碲材料,並利用幾何是簡單的製造,配置中的聲學和光學波 非共線 開發(圖1)。 在本設計中,窄帶和寬帶光的衍射光入射是分開的,因為他們退出晶體偏振器通過不同的途徑,不需要操作。 零級衍射光束可以由一個光束阻擋阻擋,而過濾的衍射光束被用於標本照明。 這種現象稱為 聲走 如圖1所示的聲群速度和聲學波法線之間的角度差,方差,是許多聲光器件常見。 在一個共線AOTF配置的意義(圖2),雖然光線的傳播方向與聲波的相速度是由定義的共線,由此產生的聲波的群速度如下一個稍微不同的角度。

當非偏振光入射光束在非共線配置(描述為一個集中的光錐,圖1),光束的衍射部分包括兩個空間分離的一階光束,正交極化的。 如果輸入光束的AOTF為線偏振光(如用激光源),隻有一個衍射光束退出裝置,其偏振狀態旋轉90度相對於輸入偏振軸。 因為兩個正交極化階梁不分開,直到他們離開的晶體,然後在一個固定的角發散,衍射角(和由此產生的圖像的空間位置)不隨波長。 在應用中,利用非共線AOTF作為可調諧濾波器,一級衍射分量允許照射樣品(通常隻有一個衍射輸出被使用),而零階光束受阻。 兩個光束是由幾度分開,這是一個功能的裝置的設計。 利用晶體具有較大的雙折射值,這 偏轉角度 (角分離的衍射和衍射光束)的增加,實現之間的衍射和衍射光束的偏振片充分的分離不使用一個理想的屬性。 由衍射光束被偏轉角度至少為二氧化碲晶體係統時,光束入射角是平行的 110。 軸(在90度到光軸),並增加了8和9度的相對於[ 110 ]軸入射角的增加之間的實際的限製。 偏轉角度之間發生的衍射和衍射光束後留下的晶體具有以下關係對晶體材料的雙折射:

θi - θd = Δn sin 2θi

在上麵的表達式中,θ(i)和θ(d)是角度,相對於所述光學軸,入射和衍射光束,分別的。雙折射是由的Δn表示。基於操作的共線模式AOTF設備,如那些使用石英作為雙折射材料,可以被認為是共線設計的簡化的變異與入射角,θ(i)中,90度,和一個零偏轉角。

雖然原則上,各向同性和各向異性的布拉格衍射圖案可以利用的光譜過濾機製,一個關鍵的限製存在於各向同性過濾介質的使用,因為光譜通帶的光入射孔徑角的變化,因此良好的準直光束是必不可少的。 角孔徑對通帶特性的事實,在入射角的變化產生的動量不匹配結果的影響,導致衍射光束被偏轉不同波長。 一個發散光束,光學通帶寬度對準直光束,急劇增加,嚴重限製了該濾波器的實際孔徑角。

各向異性的聲光濾波器具有一個很窄的通帶可以在一個大範圍的入射光束的角度保持實際優勢。 有了這個設計,衍射光束的偏振麵旋轉90度的相對衍射光束的偏振方向。 因為一般在雙折射晶體的光折射率的不平等和非凡的經曆,聲波傳播方向可選擇的事件引起的群速度和衍射光是共線(下簡稱 非臨界相位匹配 )。 在這種情況下,由入射光束的角動量失配的變化產生的最大雙折射角變化引起的偏移量。 由於非臨界相位匹配條件被滿足在一個大範圍的入射光束的角度,對非共線AOTF的視場角是比較高的,同時保持理想的特性,如窄通帶。

對AOTF的製作材料

在近年來的應用利用聲光器件的數量顯著增加,主要是由於其製造材料的改進的發生發展。 一個適當的材料的選擇取決於特定設備的目標函數。 例如,磷化镓具有寬帶聲光偏轉器和調製器的建設的優良特性,但由於其晶體結構是光學各向同性的,材料是不適合的可調諧濾波器裝置。 具體的一般要求,然而,適用於任何類型的光學裝置,其中包括高透光率在波長範圍加以利用,在足夠大的單晶體的可用性,合理的費用,除其他因素。 評估材料的性能是一個因素,稱為聲光的一個有用的變量 圖的優點 適當的定義,為特定的設備類型。 文獻提出了至少五種不同的表達式計算圖的優點,采用變量視為特定的設備功能相關。 參數通常被認為是包括的折射率,密度指數,聲波速度,帶寬,分辨率(通過各種方法定義的),以及一係列的彈光係數。 必須在AOTF設計優化的具體變量衍射效率,波長分辨率,和立體角孔徑。 無論該方程用於計算,任何數字的優點是一般表示為無量綱值歸一化到適當確定的絕對值為石英。

非共線和共線AOTFs主要規格
規格 非共線
(二氧化碲
)
共線 
(石英)
Wavelength Tuning Range 0.38 - 5.5 µm 0.2 - 1.0 µm
Acoustic Tuning Range
(Single Transducer)
1 octave 1 octave
Optical Aperture 0.1 - 1.5 cm2 0.1 - 5.0 cm2
Solid Angular Aperture 5 - 15 degrees 2 - 5 degrees
Deflection Angle (θi - θd) 3 - 9 degrees 0 degrees
Diffraction Efficiency
(Polarized Light Input)
10 - 90 percent 20 - 90 percent
Tuning Speed 4 - 20 µsec 14 - 35 µsec
Extinction Ratio greater than 1000 greater than 1000
Input RF Power 0.5 - 3 watts 5 - 30 watts
Input RF Frequency 20 - 200 MHz 50 - 220 MHz
Piezoelectric Transducer
Material
LiNbO3 LiNbO3

表1

基於它的許多良好的性質,以及由此產生的高氧化碲聲光圖的優點,是目前首選的AOTF的材料。 首次報道在非共線AOTF操作模式試驗示範使用在可見光譜區中碲晶體進行操作。 所描述的裝置是可調諧輸出波長範圍700至450納米(通帶中心)從100至180兆赫的射頻驅動頻率的變化。 過濾後的光束相對於入射光束的衍射角為6度,近百分之100的入射光被衍射在120毫瓦的功率驅動。

二氧化碲是官能在整個可見光譜並進入紅外高達約5.5微米的波長,並且具有短的波長傳輸截止在約350納米。為了給AOTF可使用的範圍延伸到遠紫外線或進一步到紅外線,另一種材料必須采用。的二氧化碲設備的初始發展後,晶狀石英被用來擴大工作範圍到紫外線,並進一步延伸到紅外區域已經完成與鉈 - 砷 - 硒結晶。擴大的光譜範圍可達到與AOTFs主要是由執行有效的材料的可用性和在所期望的波長波段的高透明性的限製。

如前麵所討論的,因為適合於共線AOTF的操作模式晶體類的有限數目的,顯著更多的努力已集中於開發材料的非共線的設備。性能規範文獻中報道的用於非共線AOTFs采用各種材料,包括二氧化碲,鉈,砷,硒,和氯化汞在紅外線操作(高達約11微米的波長)。 AOTFs用於調諧在紫外光譜區已製作由結晶石英,氟化鎂,和藍寶石(氧化鋁)。水晶是用於操作在紫外區的優選材料。因為優點為石英的聲光數字僅為約0.002的二氧化碲,石英係AOTFs具有較低的衍射效率進行,並且需要較高的或許10倍的功率值來驅動射頻換能器,在比較二氧化碲濾波器。

AOTF的功能特點

最常用的AOTF設計用於在成像係統中的頻譜控製是基於在非共線方式操作二氧化碲,並且它因此考慮該設備的某些操作特性,這涉及到它的典型應用是有用的。 AOTF的波長調諧特性是最重要的,最常見的這些應用。動量(和相位)匹配條件規定,選擇用於衍射的波長是由施加到聲換能器和所得到的聲波頻率的驅動頻率來確定。圖3示出一個典型的調諧曲線為二氧化碲的非共線的AOTF在可見光到近紅外光譜範圍內。選定的波長和施加RF頻率之間的調諧關係對兩個正交極化的輸出光束一般是不同的,並且每個的特征在於,一個單獨的數學表達式。隨聲波頻率的透射中心波長減小。的頻率和調諧波長變化的近似逆的方式,雖然這是不準確的,由於這一事實,即折射率為正常和非常光線的比例也隨波長而變化。這兩個輸出光之間的波長差,從幾納米變化到幾十納米,這取決於設備的配置。相關設計參數確定的AOTF晶體調諧關係是聲波傳播中,相對於[110]軸與入射光的輸入相對於所述光軸的,典型地被指定為α,θ(i)的角度,分別為。對這些設備的角度的一些組合中,如果入射光被偏振,隻有一個偏振分量滿足非臨界相位匹配條件,而其他表現出與入射光束的角度調諧的關係的變化。

聲光可調諧濾波器是由壓電換能器,它通常是一個八度或更低的電 - 聲帶寬在其波長調諧範圍的限製。這個值是顯著小於調諧晶體的光傳輸範圍,並且一些可商購的AOTFs設置有多個換能器,被設計為不同的帶寬,增加的可調波長範圍內。 AOTF的極其快速的調諧速度是其主要優點為在顯微鏡的照明控製之一,並且該屬性僅由彈性波的渡越時間的晶體(相當於中轉距離由聲速除以)中限定。在非共線裝置中,聲波傳播距離是名義上等於所述光學孔徑。雖然較高的聲速對應更大的調諧速度,一些材料的衍射效率,包括二氧化碲,變化為音速的立方成反比。因此,較低的聲波速度規範可有利地用於器件如AOTFs。為二氧化碲,縱波沿<001>方向上傳播的具有每秒超過400公裏的速度,而與此相反,傳播平行於<110>剪力波以每秒約617米異常低的速度行駛。這種AOTF在此“慢剪切模式”操作提供了改進的衍射效率,同時還顯示出小於10微秒調諧的響應時間。調諧速度為這種設計範圍從幾微秒至幾十取決於孔徑大小(聲波傳播的距離)和其它的配置屬性,微秒的典型AOTFs如換能器和其上的晶體放置的特性。

AOTF的波長切換功能可以被用來提供一種快速可調光源,其可以在多種模式下,都適用於光學顯微鏡下操作。單一照明波長可以按順序被調諧或隨機訪問,並且能夠同時從所述濾波器輸出的多個波長。不同於傳統的衍射光柵或棱鏡,交換可以馬上隨機指定波長之間進行不掃描通過中間波長。每個調諧的波長通過電子方式切換到對應的RF驅動頻率定向到該裝置的輸出。如果一個以上的射頻驅動頻率被施加到壓電換能器,該傳播可變聲波能夠同時衍射多種光波長。無線電頻率驅動換能器的數目和相對功率可以迅速變化,以控製所發射的光的強度和波長。可同時使用的頻率的數量是由壓電換能器的功率處理能力來確定,並且通過滿足必要為每個衍射波長的最小功率時的總驅動力的無線電頻率被應用之間進行分配的要求。基於非共線二氧化碲配置市售AOTFs,在可見光和近紅外光譜範圍內工作,通常限製在10至12個同時的輸出通道。以繼續在低功耗AOTFs的發展技術的進步,可以預測,超過100個可控製的通道將能夠與即將到來的設備。

一個可調諧濾光器的光譜分辨率的定義是在一半最大值處從所選擇的光輸出的主瓣的整個寬度,並且是兩個波長和設備的配置的功能。一個典型的AOTF的範圍從幾納米的分辨率(帶通)到幾十納米的可見光和近紅外光譜區,約三十分之一的普通布喇格衍射的值。影響分辨率的設計參數包括結晶材料的分散常數(與雙折射的程度),則入射角,並且聲光相互作用長度。

根據目前的理論理事AOTFs的調諧特性,具有波長正好滿足相位匹配條件僅光源的衍射光束(S)中被發送,對於具有無限大的聲光相互作用長度的裝置。然而在實踐中,有限的相互作用長度的結果,在濾波器的通帶,它定義了設備的光譜分辨率的擴大。相反,衍射光柵,在一半最大值處的AOTF的透射峰的變化,因為波長的平方的函數的整個寬度,從而產生可變的帶通。掃描時,在整個波長調諧範圍,典型的AOTF可見光譜區域內運行呈現出帶通規範的變化大約2〜6納米。

在非共線的AOTF設計的,如前麵所討論的,所施加的RF頻率和衍射的波長之間的調諧關係對兩個正交極化的一階光束不同。因此,他們的波長是不同的,隻有一個符合非臨界相位匹配條件,這是可取的,以便最大限度地考慮到設備的視場角。在一些需要從AOTF增加輸出強度的應用中,有利的是利用結合衍射輸出。雖然有可能用標準的AOTF選擇輸入入射角相對於固定的晶軸與聲傳播方向而導致在這兩個偏振光束的等效調諧關係的,這種策略減少了光譜分辨率。特殊用途的二氧化非共線AOTFs碲也已製成具有專門選擇,以產生具有相同的調諧關係衍射輸出的設計參數,並與兩個滿足在近紅外光譜區的非臨界相位匹配條件。

作為施加於激光掃描共聚焦顯微鏡中,AOTF的最顯著優點之一是它的能力來代替更為複雜和笨重的過濾機製,用於控製光的傳輸,並施加強度調製的波長鑒別的目的。執行中的衍射光束的強度和波長極其快速調整的能力使AOTF獨特的控製能力。通過改變在不同波長的照射強度,多個熒光團的反應,例如,可以實現最佳的檢測和記錄均衡。另外,隨著相位和頻率鎖定技術的數字信號處理器可以被用來從多個熒光團區分發射或從背景中提取的低電平信號。

利用一個聲光可調諧濾波器,用於共焦顯微鏡的實用光源配置方案被示於圖4中三個激光係統(氦 - 鎘,氬氣和氬氪氣)的輸出被二色反射鏡通過AOTF合並​​,並指示其中所述第一級衍射束(綠色)是共線的,並且發射到單模光纖。的非衍射的激光束(綠色,黃色和紅色)退出的AOTF以不同的角度和由波束停止吸收(未示出)。由每個激光產生的主要線(波長)來表示(單位為納米)下的熱和冷鏡。二色鏡反射的波長比525納米的低,發射波長更長。通過氬 - 氪激光器(568)和(648納米)的產生兩個較長波長的線由熱反射鏡反射,而氬激光(458,476,488,和514納米)的輸出被二色反射鏡反射,並結合與來自氬 - 氪激光器所發射的光。從氦 - 鎘激光(442納米)的輸出由冷鏡反射的和結合的較長的波長從其他兩個激光器,它通過反射鏡發射。

因為從AOTF晶體的聲學換能器的快速光響應的,聲光相互作用是受突然的轉變類似於一個矩形,而不是正弦波形。這導致在旁瓣中的中央透射峰的任一側上的聲光可調濾波器的通帶的發生。在理想的聲 - 光條件下,這些旁瓣應當是對稱的左右中央峰,與具有中央峰的強度為4.7%的第一葉。在實踐中,旁瓣通常是不對稱的,並表現出從預測的結構等的偏差,在聲光相互作用引起的變化,以及其他因素。為了減少在通帶內,以不顯著水平的副瓣,多種類型的彈性波的振幅變跡都采用,包括各種窗函數,已發現30到40分貝抑製的最高旁瓣。可在減少與非共線AOTFs旁瓣電平的可使用的一種方法是通過對換能器的加權激勵的手段來應用空間變跡。在共線聲光濾波器,采用不同的方法已經被使用,它引入了一個聲脈衝,變跡的時候,進入過濾結晶。

一個AOTF的有效線性孔徑由一維聲束的高度和由在其他維度橫跨光學孔徑的聲衰減(在聲波傳播的距離)的限製。在AOTF晶體內所產生的聲束的高度由性能和聲學換能器的物理特性決定的。在晶體材料如二氧化碲聲衰減正比於聲頻率的平方,並且因此是一個比較麻煩的限製線性孔徑大小在更短的波長的可見光範圍內,這就需要更高的RF頻率進行調諧。近紅外和紅外輻射產生的,因為與這些較長波長的衍射相關聯的較低的聲頻率的限製較少的限製。 

單個聲換能器的最大尺寸是由性能和功率要求除了儀器配置的幾何限製的約束,並AOTF設計人員可使用換能器結合到晶體的陣列,以增加傳播的有效橫向尺寸聲束,並以放大的聲光相互作用的區域。所需要的驅動功率是在聲光設計中最重要的變量之一,並且通常與光學孔徑和更長的波長而增加。相反,聲衰減,這是減少在紅外光譜範圍內,以驅動換能器的紅外線AOTFs需要更高的功率是在這些設備的最大限製之一。高的驅動功率電平導致的晶體,這可能會導致熱漂移和不穩定的濾波器性能的加熱。這是特別的一個問題時,聲功率和頻率而變化迅速,大範圍的,和晶體溫度沒有足夠的時間來穩定,產生的折射率瞬態變化。如果應用程序需要的波長和強度的穩定性和可重複性,在AOTF中應保持在一個恒定的溫度。采取由設備製造商,以盡量減少此問題的一種方法是將加熱超過環境溫度的晶體,到一定程度,它是相對地不受由換能器的驅動功率的附加的熱輸入。另一種解決方案是,房子在一個熱電的AOTF冷卻外殼,可提供精確的溫度調節。持續發展努力承諾導致新的材料,可以提供相對較大的孔相結合的過濾和未過濾束的有效分離,不使用偏振器,而需要的典型裝置的驅動功率的一小部分。

在非共線的AOTF,其在空間上分離的入射光和衍射光的路徑時,偏轉角(對角分離衍射和非衍射光束離開晶體)是一個額外的因素限製了裝置的有效孔徑。如先前所討論的,偏轉角為大於對於具有更大的雙折射晶體,並且確定部分所需的衍射和非衍射光束的足夠的分離的傳播距離離開晶體後發生。所需的距離增大為較大的入口孔,和該規定,因為對組件的物理尺寸可以被並入到顯微鏡係統約束對最大孔徑大小有實際限製。的孔徑角是關係到AOTF中,在成像係統中的一個重要因素的總集光功率,雖然為了實現全孔徑角而不在非共線的AOTF使用偏光板,其值必須是比偏轉角小。 

因為聲光可調諧濾波器是不顯微鏡係統的圖象形成部件(因為它通常被用於源過濾),有評價的空間分辨率為這種類型的設備的任何特定方法。但是,聲光可調濾波器可以限製由於其有限的線性孔徑大小和接受角的成像係統的可達到的空間分辨率,以相同的方式與其他的光學部件。根據瑞利準則和AOTF的角位移和線孔,可分辨的圖像元素的最大數量可以被計算為一個給定的波長,使用了極性和方位角的平麵不同的表達式。盡管衍射極限的分辨率可以得到在方位角平麵上,分散在AOTF限製在極性麵的分辨率,並且必須采取措施來抑製這種因子,以獲得最佳的性能。上波長的偏轉角的依賴性可以產生一種形式的分散體中,當在一個相對窄的帶寬進行調整,但在涉及操作在寬的光譜範圍內的應用程序顯著通常是可以忽略的。變化與波長的偏轉角可以在調節過程中產生的圖像的變化,在諸如激發的不同波長的熒光的比值的成像技術產生的錯誤,並且在其他多光譜的應用程序。時的圖像偏移服從一個已知的關係,以波長,校正可通過數字處理技術被應用。分散體的其他作用,包括降低的角分辨率,可能會導致圖像質量下降,如模糊,這需要更複雜的措施來抑製。

在共聚焦顯微鏡AOTF優勢總結

綜合考慮,涉及到AOTFs在成像係統中的應用程序的操作和性能因素的基本原則,許多這類設備的光控熒光共聚焦顯微鏡的優點是顯而易見的。 AOTF中的幾個好處結合起來,極大地提高了最新一代的激光共聚焦儀器的多功能性,而這些設備正在成為流行的激發波長範圍和強度的控製越來越多。促進所述的AOTF的幾乎每一個優點主要特性是它的能力,以允許在逐個象素的基礎上的強度和/或照明波長的顯微鏡控製,同時保持高的掃描速率。這個單一特征轉化成各種各樣的有用的分析顯微鏡工具,其進一步在靈活性增強當激光照射時使用。 

其中最有用的AOTF功能允許的小用戶定義的試樣的區域(感興趣的通常被稱為區域; ROI)的選擇,可與任一較大或較小強度被照亮,並在不同的波長,用於精確控製在漂白工藝,激發率研究,共振能量轉移的調查,或光譜測量(參見圖5)。照明強度,不僅可以在選定的區域可以增加控製的光漂白實驗,但可以衰減在所希望的區域,以減少不必要的光漂白。當該照明區域是根據AOTF控製,激光曝光被限製為默認的掃描區域,以及該裝置的非常快速的響應可以被用來檢流計掃描鏡周期的回掃間隔期間提供光束消隱,從而進一步限製了不必要的標本暴露。在實踐中,激發地區按徒手畫或使用工具製作所定義的幾何形狀,在電腦顯示器上的圖像覆蓋麵通常定義。一些係統允許激光照射來定義任意數目的樣本區,激光強度被設置為不同的電平的每個區域中,在強度增量小到了0.1%。當AOTF是結合多個激光器和軟件,允許連續觀測的時間過程控製,時間推移實驗可設計成獲得在單次實驗中,這可能,例如,被定義為對應於不同的從幾個不同的區域的數據細胞器。 

圖5示出了興趣(投資回報),在激光掃描共聚焦顯微鏡先進的熒光應用中創建用戶定義的區域的幾個例子。在每個圖像中,投資回報率都列出了一個黃色的邊框。在圖5中給出的鼠袋鼠細胞(PTK2線)(a)的矩形區域中已被指定為光漂白實驗細胞質的中央部。駐留在這個區域的熒光團可通過高功率激光強度被選擇性破壞,熒光的後續恢複監視測定擴散係數。幾個徒手的ROI被顯示在圖5(b)所示,其可以是目標對選定的照度或光漂白實驗。 (;麂細胞與黃色熒光蛋白圖5(c))在共振能量轉移(FRET),熒光發射率可以通過在共聚焦顯微鏡的選定區域通過觀察漂白在這些方麵的受體熒光的效果容易地確定。激光激發的在選定區域具有共焦顯微鏡的AOTF控製也是蛋白質擴散的使用熒光蛋白在光活化的研究調查是有用的,如圖5(d)所示。此圖像幀呈現在楓蛋白的熒光發射峰,因為它從綠色轉變為紅色的HeLa使用所選照明(黃色方塊)與405納米的藍紫色激光二極管(人宮頸癌)細胞。

AOTF的快速強度和波長切換功能可在每個激發波長可以以平衡各信號電平,以獲得最佳的成像被分配一個不同強度的多個激光線將被執行的順序線掃描。從各熒光團同時減少交叉,可以是具有同步多波長勵磁用顯著問題個別的行順序掃描減少信號采集之間的時間差(參見圖6)。多個熒光探針的同步摻入活細胞已經發展成為一個非常有價值的技術的蛋白質 - 蛋白質相互作用的研究中,與高分子複合組件的動態特性。的技術將綠色熒光蛋白(GFP)及其眾多衍生物進入細胞的蛋白合成機製的細化已經徹底改變了活細胞的實驗。用活組織多個探頭研究的一個主要挑戰是必須要獲得完整的多光譜數據集的速度不夠快,以減少樣本的運動和分子的變化,可能扭曲真實的試樣幾何形狀或事件的動態序列。在AOTF中提供的速度和多功能性,以控製波長和強度照射多個樣品的區域,並同時或依次掃描各以足夠的速度準確地監測動態細胞過程。 

AOTFs和中性密度濾鏡的應用程序來控製激光共聚焦顯微鏡的熒光光譜分離的比較示於圖6。標本是貼壁赤麂鹿沾上的Alexa Fluor皮膚成纖維細胞568結合到鬼筆環肽單層培養(目標絲狀肌動蛋白網絡)和SYTOX綠色(染色在細胞核中的DNA)。產生的高激勵信號所必需的兩種熒光團中性密度濾光片導致顯著量泄流通過SYTOX綠發射的進入的Alexa Fluor568信道(圖6的(a),記下黃核)。 SYTOX綠和Alexa Fluor568之間的共定位的高度在圖6中清楚地示出的散點圖(b)所示。在散點圖兩軸代表SYTOX綠色(橫坐標)和的Alexa Fluor568(縱坐標)的渠道。為了平衡所必需的激發功率水平來選擇性地照射每個熒光團具有更大的控製發光強度的,一個AOTF被用於選擇性降低SYTOX綠激發功率(氬離子激光線在488納米)。注意,在隨後的減少滲出,通過如在圖6(c)該細胞的細胞核表現為綠色。相應的散點圖(圖6(D))表示滲出通過SYTOX綠色的顯著水平降低到的Alexa Fluor568路。 

AOTF的發展光漂白(FRAP),熒光損失在光漂白(FLIP),以及在局部光活化熒光(解籠鎖)的研究(參見圖5)後,提供了大量的附加的通用性,如熒光恢複技術。該FRAP技術的初衷是測量熒光標記蛋白質的細胞器和細胞膜擴散速率。在以往的FRAP過程,在試樣上的一小點被連續地照射在低光束的水平和所發射的熒光進行測定。的照度水平,然後上升到非常高的水平很短的時間通過快速漂白破壞在被照射的區域中的熒光分子。後的光強度,返回到原來的低電平時,熒光被監測,以確定在哪些新的漂白的熒光分子擴散到耗盡區的速率。的技術中,作為一般使用,已經由漂白的區域,這往往是受衍射限製光斑的固定幾何形狀的限製,並且由具有以機械方式調節的照明強度(使用擋板或檢流計驅動的組件)。在AOTF中,不僅允許的光強度接近瞬時切換,但也可以用於選擇性地漂白的不規則形狀,線,或特定的細胞器,隨機指定的區域,並確定分子轉移到該區域的動態。 

通過使照明光束的幾何形狀和波長和強度的快速切換的精確控製,在AOTF是顯著增強應用的倒裝技術在測定某些細胞蛋白質的擴散遷移率。這種技術監測的熒光從連續點亮局部區域的損失和熒光團從遙遠的地方到枯竭的網站再分配。獲得的數據可在細胞內和細胞間部件之間的動態相互關係的確定有助於活組織,並且這種熒光損失研究是由AOTF的控製的顯微鏡照明的能力極大地方便了。 

利用光活化的熒光的方法已在研究中非常有用,例如那些研究中的細胞過程的鈣離子濃度的作用,但在它的靈敏度一直局限於在小細胞器或靠近細胞膜局部區域的效果。通常,通過被結合到光敏物質失活的熒光物質(稱為被籠)是由從隔離罩化合物釋放它們,並允許他們通過熒光突然出現的被跟蹤強光照射激活。利用聲光可調濾波器的推動了這種研究,以評估高度本地化的過程,如鈣離子動員膜附近,因為做照明觸發感興趣的熒光分子的活化(解籠鎖)的精確快速控製可能的改進。 

由於AOTF中的功能,在不使用移動的機械部件的,以電子方式控製的波長和多個激光器的強度,大的通用性被設置為外部控製和帶的顯微鏡實驗等方麵的激光照射的同步。當共聚焦儀器配有一個控製器模塊具有輸入和輸出觸發端子,激光強度水平可以連續地監測和記錄,並且所有的激光功能的操作可以被控製與其他試驗樣品的測量,自動化顯微鏡載物台的運動,以協調,連續的慢速錄製,以及任何數量的其他操作。



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