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新聞資訊

徠卡顯微鏡EM ACE600電子束

2014-09-07  發布者:admin 

甘油噴霧/低角度旋轉遮蔽是在生物學用於可視化的結構,得到與其他技術不足等相反,製劑技術,由於其直徑小。此方法通常用於標本,其中包括與卷曲螺旋結構域或DNA的蛋白質。

樣品製備包含三個步驟:首先,標本的小水滴懸浮在一個緩衝區包含30%甘油和乙酸銨緩衝噴灑到新鮮貼近,幹淨的雲母片表麵。 第二步,樣品轉移到高真空蒸發器:這個工具允許存款薄層的電子致密物質(通常是Pt、W或非盟)在低角度到樣品。 蒸發物質積累主要在提高樣本,從而提供了對比。 隨後,一層支持C是蒸發到標本提供支持。 在第三步中,副本形成脫離的雲母和安裝到EM電網教具電子顯微鏡檢查。

徠卡EM ACE600配備Pt / C和C電子束蒸發,第二步可以完全自動化:從樣本已經轉移到收件人的高真空蒸發器,直到程序結束,儀器充分控製真空,標本的位置相對於金屬/碳源和沉積材料的厚度。

編程序列

兩個電子槍支使用在這個準備的過程中,這兩個需要脫氣,以避免相當退化的真空由於加熱在當下的實際蒸發開始。 而不是兩個後續德加/泵/蒸發周期Pt / C和C,它是首選先德加兩槍,然後泵需要相當長的時間來達到一個好的過程真空蒸發材料。 一個自動序列正在這裏描述實現該方法。 Pt / C槍安裝在正確的端口,C槍在左邊。

材料

  • 材料使用Pt標準定義的“白金德加”設置,50 W脫氣的力量,和120秒脫氣。
  • 材料使用C標準設置“碳德加”的定義,75 W脫氣的力量,和300秒脫氣。
  • 兩種材料“鉑沒有德加”和“碳不德”具有相同的屬性定義為原始材料,但脫氣是停用。

流程

  • 過程“脫氣Pt / C”旨在德加Pt / C槍隻是編程使用的材料“白金德加”。 這一過程將開始為1.0×10 mbar,蒸發低30 W的力量,和目標厚度為0.0 nm打開快門後立即終止。 設置階段地位因此過時了。
  • 脫氣過程”C”旨在德加C槍隻是編程使用材料“碳德加”。 這一過程將開始為1.0×10 mbar,蒸發低30 W的力量,和目標厚度為0.0 nm打開快門後立即終止。 設置階段地位因此過時了。
  • 過程“陰影Pt / C”程序使用以下設置:材料“鉑不德”,功率100 W目標,目標厚度2.0 nm,真空< 2.5×10 mbar、舞台在-54°傾斜(對應於5°相對於槍),最大工作距離,旋轉5(最大值)。
  • “支持度”是編程過程使用以下設置:材料“碳無德”,120 W targat力量,目標厚度6.0 nm,真空< 2.5×10 mbar,舞台上20°傾斜(相對於水平),最大工作距離,旋轉5(最大值)。

序列

  • 一個序列組成的“脫氣Pt / C”,“脫氣C”,“陰影Pt / C”,“支持度”準備。

準備

在實驗之前,Pt / C和C槍清洗徹底,細絲的目標和建立根據手冊。 Pt / C槍是安裝在真空室的正確的端口,C槍在左邊。 佬司的儀器成立(低角度旋轉跟蹤)階段和石英晶體在側臥位。

130µg /毫升dsDNA長度1010完全(對應343海裏)在噴灑稀釋1:20緩衝區(100中毒/ l醋酸銨,30%的甘油,pH值7.6)。 小水滴噴灑噴霧裝置中描述到新開辟的雲母片表麵大約2×2毫米大小和安裝與雙麵膠帶在50毫米圓形濾紙。

噴灑後,對濾紙樣品立即轉移到隨時準備徠卡EM ACE600和疏散。 上麵列出的順序與被處決,商會是在完成時自動排放。

濾紙上的副本被從真空室和轉移到潮濕的cham-ber,製成的塑料盤子,封口膜(使樣本變濕),和濕濾紙。 促進超然的複製品,他們孵化在烤箱45°C 30分鍾。

隨後,副本是浮在表麵的蒸餾水在一個白盤子裏,挑了一個un-filmed 400目銅網格,ddH轉移到另一個盤 O所有殘餘有機物的去除(甘油),拿起另一個網格。 多餘的水從側麵塗抹和技巧的濾紙的鉗,樣本被風幹。

空氣幹燥的副本在透射電子顯微鏡下觀察到在80千伏,感興趣的區域可以通過晶體的殘留鹽形成的中心幹水滴中描述。 圖像記錄用CCD相機的像素大小0.373 nm /像素。

 

圖1:如在透射電子顯微鏡中的文本描述和可視化製備的低角度旋轉遮蔽的DNA。單個分子是清楚可見的,並顯示出良好的對比度。使用斐濟,340納米的平均長度測量組(n =8)。 (下圖)在較高的放大倍數圖像允許評估對比增強金屬的粒度。杆(頂部,底部)= 100納米


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