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奧林巴斯顯微鏡的圖像亮度

2014-09-25  發布者:admin 

  無論是利用光學顯微鏡的成像方式,圖像的亮度是由物鏡的聚光能力,這是一個數值孔徑函數。 正如顯微鏡光源照明亮度的平方器工作的數值孔徑的測定,試樣的圖像亮度的物鏡的數值孔徑的平方成正比。

不像在顯微鏡的照明係統,形勢然而,物鏡放大倍數確定圖像的亮度也起著重要的作用。 事實上,該圖像的亮度的橫向放大率的平方成反比

圖像的亮度∝(Na/m) 2

在那 na 是物鏡的數值孔徑和 M 為放大倍數。 在上麵的等式給出比透照表示物鏡的聚光能力(注:用Epi照明的情況有所不同,下麵討論)。 對選定的物鏡有不同程度的光學校正光功率的例子列於表1。 在一般情況下,具有高數值孔徑的物鏡也更好的校正像差。 因此,對於相同的放大倍率,高數值孔徑物鏡收集更多的光線,產生一個明亮的和更好的校正後的圖像(見表1),和總體形象是更好的解決。

這是明顯的從檢查表1中的數據的情況下,一個物鏡是用於透照,在一係列具有相同的校正物鏡的放大倍數增大圖像的亮度迅速下降。 與此相反,的EPI照明物鏡的一係列類似的利用產生了越來越明亮的圖像的放大倍數增大通過較低的範圍(10倍,但往往通過40X)在高放大倍率的降低。 同樣明顯的是物鏡在落射光照產生更明亮的圖像的趨勢(如反對透照)在高數值孔徑值。

條款 F(反式) F(EPI) 這是利用在表1指的是一個物鏡的聚光能力,並根據下麵的公式計算

F(trans) = 104 • NA2/M2

F(epi) = 104 • (NA2/M)2

在理論上,光照強度取決於聚光鏡數值孔徑的平方和的光源圖像demagnification廣場(實際上,視場光闌圖像變亮,因為它是小的,根據平方法)。 結果表明,試樣的圖像亮度的物鏡的數值孔徑的平方成正比,當它到達目鏡(或相機係統),並對物鏡放大倍數成反比。 因此,當檢查標本在透射光,而不改變電容影響響應和放大的數值孔徑變化的圖像亮度變化的目的。

選定的物鏡光功率
糾正 放大倍數 數值孔徑 F(trans) F(epi)
Plan Achromat 10x 0.25 6.25 0.39
Plan Fluorite 10x 0.30 9.00 0.81
Plan Apo 10x 0.45 20.2 4.10
Plan Achromat 20x 0.40 4.00 0.64
Plan Fluorite 20x 0.50 6.25 1.56
Plan Apo 20x 0.75 14.0 7.90
Plan Achromat 40x 0.65 2.64 1.11
Plan Fluorite 40x 0.75 3.52 1.98
Plan Apo 40x (oil) 1.30 11.0 18.0
Plan Fluorite 60x 0.85 2.01 1.45
Plan Apo 60x (oil) 1.40 5.4 10.6
Plan Apo 100x (oil) 1.40 1.96 3.84
Plan Apo 100x (oil) 1.45 2.10 4.42
Plan Apo 100x (oil) 1.65 2.72 7.41
表1

在落射光照的情況下,適用同樣的考慮,除了物鏡也作為聚光鏡,這必須考慮到當考慮到圖像的亮度。 作為物鏡放大倍數的增加,降低了光源的圖像(demagnified)的等效量,導致在一個亮度水平是不物鏡的放大和數值孔徑越依賴(亮度是由在落射照明數值孔徑第四功率)。 在實踐中,圖像的亮度數字有所不同(見表1)由於物鏡後孔徑大小的差異。

當光線水平限製,高數值孔徑的物鏡應采用,但兩者的物鏡和目鏡放大率應保持在所需的分辨率兼容的最低水平。 在許多情況下,製造商現在提供的油浸物鏡的數值孔徑和相對較高,更高的圖像的亮度值,比類似的放大率高的幹同行。 例如,複消色差物鏡40x的計劃表1中已兩次計劃的消色差透鏡40X幹物鏡數值孔徑,並產生四倍的圖像亮度在透射光。 這些物鏡產量的落射熒光照明下的圖像亮度的16倍的差異,與高數值孔徑油浸版生產最亮的圖像。 圖2給出了在光錐尺寸低和高數值孔徑的物鏡之間的相對差異的比較。 請注意,高數值孔徑的物鏡有一個更大的光錐,較大的內部透鏡元件,並且能夠收集更多的光線從樣品比物鏡具有較低的數值孔徑。

通過顯微鏡的光學元件發出的光的量,作為入射強度的功能,是特別重要的熒光顯微鏡。 在這種情況下,高分辨率熒光成像需要高倍率最小損失圖像的亮度,高數值孔徑物鏡的光傳輸最大程度應采用。 正如上麵所討論的,隨著放大倍數增大圖像的整體亮度迅速下降,所以熒光顯微鏡的組成應仔細選擇最大的光穿過光訓練量。

如上所述,熒光顯微鏡,利用EPI照明配備物鏡服務的聚光鏡和物鏡的雙重目的。 光通過激發濾光片,在濾光立方體的雙色鏡麵反射首先通過物鏡形成一個倒錐形照明需要激發試樣。 二次熒光通過連接到試樣的熒光團發射則是由同一物鏡係統收集和傳遞回通過雙色鏡和屏障過濾之前被投射到目鏡或成像係統。 高數值孔徑的物鏡作為一種聚光鏡會增加信號(光)中的方式,是對數值孔徑的平方成比例的強度。 由於物鏡的聚光能力,也是對數值孔徑的平方成正比,圖像的亮度會有所不同的物鏡的數值孔徑第四功率根據方程

圖像亮度(熒光)∝鈉 4 / M 2

請注意,在熒光顯微鏡下,亮度也到物鏡放大倍數成反比的方。 因此,對於相同的放大率的物鏡,兩者的光場圖像的亮度與物鏡的數值孔徑的熒光圖像的顯著增加,這是主要的原因,製造商生產的設計與熒光顯微鏡高數值孔徑的物鏡。

采用觀察標本進一步放大的衍射限製的圖像投射到顯微鏡的目鏡中間圖像平麵,和也有助於降低整體強度的標本。 事實上,圖像的亮度的目鏡放大率的平方成反比,要求有最低的放大需要方便地觀察標本采用熒光目鏡。 因此,可以通過使用可用的最高數值孔徑耦合到功率最低的目鏡的最大熒光顯微鏡圖像的亮度(雖然10X目鏡是最常用的)。 這些評論主要適用於大樣本地區有照明均勻度。 在高度集中的光源點的情況下(例如,分鍾的熒光微球),粒子圖像應有限衍射和尺寸是獨立的放大。

提高試樣的信號

在熒光顯微鏡,圖像的亮度的光照強度的測定,熒光的量子產率,和顯微鏡的聚光能力。 更大的光照強度和量子產率較高,更大的熒光信號和明亮的圖像變得直到所有的熒光基團的飽和。 同樣,在偏振光,圖像的亮度是受光照強度與試樣折射延遲。 在值到一個四分之一波長較大的延遲的延遲,產生更大的雙折射,從而更強的信號。

在這兩種情況下,圖像的亮度是從樣品的信號控製,這是一個產品的光照強度和光的試樣引入的變化。 在發光的情況下,在標本本身發出的光亮度,顯然是由光的大小,或信號,由樣品發射。

這一概念是在圖3和圖4所示的熒光和偏振光標本,分別。 圖3給出了從夾竹桃葉薄片被落射光照條件下的一個立體顯微鏡配備熒光照射對數字圖像。 當薄片與賦予綠色熒光蛋白(GFP)激發具有450和490納米之間的帶通濾波器組的範圍內,試樣表現出弱的綠色熒光(圖3(a)),標本中的某些部分非常明顯,但很弱的人。 相反,一個較長的波長的帶通濾波器組試樣激發(530-560毫微米;圖3(b))產生一個明亮的紅色熒光具有更強的信號在薄片。

類似的情況與極化礦物薄切片光鏡觀察,如圖4所示。 試樣拋光的30微米區段斜長岩,火成岩幾乎完全由長石。 當高度取向的雙折射薄膜部分設置與光軸垂直於偏振器,光(信號)通過分析儀最小化(圖4(a))。 然而,當光軸取向在45度角相對於分析儀和偏振器(圖4(b)),光的最大數量被目鏡或圖像傳感器。

在其他模式的顯微鏡,如相襯,微分幹涉對比(DIC),暗場,霍夫曼調製對比度,等,照明和圖像對比度的強度可以獨立變化。 然而,信號從圖像,即圖像的亮度,每在一個光學參數變化單元的增量(例如,不同的路徑長度),仍然是由光照強度和生產的單位變化的光學參數的對比確定產品。 檢測任何光學參數的微小變化,其技術人員應該最大限度地從特定的參數變化所產生的信號。

通過顯微鏡透射光

對於一個給定的聚光鏡和物鏡的數值孔徑,放大,和照明亮度,圖像亮度的顯微鏡生產仍然可以根據透射光學元件的變化。 光傳輸取決於幾個因素,包括吸收的鏡頭和水泥,反射損耗的光纖接口,和透射率的燈套,漫射屏,過濾器,偏振器,和其他輔助光學元件。 一組選定的高數值孔徑物鏡的典型的傳輸曲線如圖1所示。 這些值是更多或更少的從一個特定的製造商的任何類物鏡的代表,但即使在這些測量曲線的具體類型,準確傳遞的值可以變化有所不同,例如,抗反射塗層,用單個透鏡玻璃批量。

透光率(強度發射的入射強度的百分比)的一些光學元件可以在可見光範圍內的波長依賴性,如圖1所示。 同時,在可見光範圍內的波長,透鏡,棱鏡的透射率,幻燈片,和樣品的安裝介質可以下降明顯。 這是由20倍的計劃氟物鏡傳輸特性曲線如圖1所示的例子,說明在透光率穩步下降,在波長為400和700納米之間增加。 該係列中的其他物鏡沒有表現出這樣的一個顯著的程度的波長依賴性。

200以上的光學玻璃的配方已被開發和可用的光學設計師納入顯微鏡透鏡,反射鏡,過濾器,和分光鏡。 這些眼鏡的屬性,如折射率,色散,傳輸,汙染物,潛在的自體熒光,化學和熱電阻,和整體性通常是精心挑選,保證最大的光學性能。 然而,這些因素往往妥協的其他要求,如在近紫外範圍或高消光係數高透射偏光顯微鏡 一些新的材料,如玻璃的方法fluorocrown,天然螢石性能同時避免它的缺點,如有機汙染物的存在和晶體結構,這可能會嚴重降低性能的熒光、偏光顯微鏡。 完全複消色差校正,但是,仍然需要天然螢石和眼鏡,在近紫外範圍減少傳輸。 一個理想的妥協往往是半複消色差透鏡或螢石的物鏡,這是一個真正的多用途的物鏡,很好的校正相結合具有良好的對比度,高數值孔徑值,和高光譜的吞吐量。

盡管光膠的厚度平均隻有約10微米或更小,水泥放雙線或多個透鏡元素之間的光譜吸收特性,有可能使一個物鏡的不適合特定的應用程序。 在大多數情況下,化學和光學玻璃的光學性能,和光學水泥,通常是專有的。

在玻璃表麵反射光線的空中接口和傳輸損失的結果,即使在沒有光的吸收和光束垂直於界麵的事件。 當入射角增加,增加的方式是依賴於光波的振動方向的定位和傳輸損耗的反射(垂直或平行於入射麵)。 每個未空玻璃界麵可以反映出四和百分之五個垂直於表麵的入射光束之間(見圖5)。 透光率每通過一個未經處理的接口將95到百分之96在正常的發病率。 通過應用 抗反射塗層 (通常是一個季度波幹擾膜厚與適當的折射率),在玻璃表麵的光反射可以在中等範圍的波長和入射角度減少到百分之一或更少,在400和850納米之間的波長範圍內的5的數字說明。

多層減反射塗層已被開發,可以減少空氣的玻璃界麵的低的值,在更廣泛的波長的百分之0.1反射。 大多數的常用的多層幹涉膜稍有綠的色彩,與單層塗層的紫色色調,使它們更容易識別。 一些抗反射塗層,特別是多層的,行為的各向異性的非正常的入射波的偏振依賴性可以大大降低光學係統的消光係數。

作為物鏡的複雜性的增加,更多的鏡頭的元素是必需的,這突出了需要消除內部反射產生更高的傳輸,更好的對比度,和更少的耀斑。 這些屬性是特別重要的事件或反射光的應用。 單層抗反射塗層,可以追溯到20世紀40年代以來不斷完善和補充的多層塗層,增加傳輸在可見光譜範圍內通過空氣的玻璃接口從百分之96左右(不包)到百分之99.9(利用多層塗層,如上所述,在圖4和圖5所示)。 圖6說明了多次反射在玻璃表麵的影響具有折射率(分別為1.5和1.8的上部和下部的圖紙,)。 在較低的折射率(1.5),八個元素的16麵,各反光約百分之四的入射光,在吞吐量隻有百分之52的結果。 相反,高折射率玻璃元件(1.8),16的未塗覆的表麵將隻有百分之26的入射光。 單層減反射塗層增加了傳輸到百分之85,而多層塗層增加這個值約百分之94.6。 這增加的吞吐量和降低相應的內部的散射和噪聲,大大提高了圖像的對比度,因為它使光明和黑暗的顏色鮮明的特點。

塗層材料是氟化鎂或大量的專有材料,它們都有自己的光學性質可能會影響在給定的光譜區域的光學係統的傳輸。 在一般情況下,抗反射塗層的幹擾特性和頻譜有限,在可見光範圍內的高傳輸性幹擾手段在諧波相關的頻率在傳輸帶的破壞性幹擾。

大多數現代的高數值孔徑的物鏡具有高度的光學像差校正包含多達15個獨立的鏡頭和多達10空玻璃界麵。 如果鏡頭無塗層,反射損耗的軸射線單獨將這些物鏡的透光率約百分之50。 所有的表麵塗層使用單層或多層幹涉膜,透光率可提高到約86至百分之90。

除了這些透鏡元素的發現物鏡,有可能存在兩個和四個的玻璃-空氣界麵之間在現代顯微鏡的光學係統

  • 燈箱和集 - 4-6個人透鏡元件
  • 內部的光學列車 - 2-8鏡,棱鏡,和中繼透鏡
  • 濾波器 - 2-8單位在傳輸或免疫熒光
  • 分光鏡 - 1-4單元觀察管和攝像係統
  • 聚光鏡- 4-8鏡片,根據光學校正
  • 標本 - 0-4包括幻燈片和蓋玻片
  • 目鏡 - 4-6取決於光學校正設計
  • 攝像係統 - 2-6透鏡,反射鏡,和過濾器元件

在極端的情況下,可以有多達五個光纖接口時的物鏡包括。 小於百分之9的軸向光將透過顯微鏡60無塗層的界麵,和一個小的在所有百分之50麵塗。

高質量透鏡塗層是必不可少不僅通過顯微鏡提高了光的傳輸,但也降低由於在玻璃表麵多次反射閃光。 然而,即使是最好的塗層不會超出一定波長範圍內工作。 對於某些波長,塗層可以提高反射率(半波幹涉膜是一種完美的反射器)。 這是一個重要的一點要記住,用CCD攝像機,數字成像的光電二極管,光電倍增管,或視頻傳感器,其中光檢測器的靈敏度,能峰波長從人眼的相當遠。

此外,反射損耗的光纖接口,通過光傳輸阻塞 燈套 可能會降低圖像的亮度。 當燈的年齡,玻璃或石英護套可能開裂或使它成為devitrifies或塗或滲透的霧化金屬從燈絲或電極蒸發。 值得注意的是,燈的透光率可能下降更快的夾克在紫外比可見光區域。 在這種情況下,可見光的亮度或亮度,用光度計測量,可能是汞或氙弧燈的紫外線輸出一個貧窮的指標。

毛玻璃漫射屏隻發送10到百分之15的光在其正常的百分之三。 不光是在斜入射角的傳播。 因此,地麵玻璃擴散器應避免在光照水平必須最大化。

過濾器和雙色鏡下有傳輸通帶變窄。 許多幹擾濾波器傳輸隻有15到百分之30的入射能量在傳輸峰值波長。 然而,一些選定的多層幹涉濾光器的一半的傳輸帶寬窄作為50埃可以提供百分之75或更大的峰值透射率。

偏振濾光片偏振和微分幹涉對比(DIC)光學也可以大大減少傳輸的光通過顯微鏡。 甚至當起偏器和檢偏軸設置在峰值傳輸一個平行的位置,一個偏振濾波器組的透光率,每百分之20個自然光透過率,僅為百分之8。 相反的,高質量的 方解石棱鏡 帶防反射塗層蓋板可以對入射的非偏振光的每雙百分之50的最大理論。

圖7給出了在現代光學顯微鏡用於傳輸和反射光的照明和觀察內部透鏡元件實例。 注意玻璃空中接口在鏡座燈和透鏡場和垂直照射類似數量之間的大量。 也有大量的接口在Windows,棱鏡,和觀察管和目鏡的鏡頭,以及物鏡轉盤和聚光鏡組件。

如上所述,多種因素可以通過現代顯微鏡的許多光學元件限製光傳輸。 其中一個是爭取最高的分辨率,特別是在增強模式下的圖像本質上是模糊的,所有前麵列出的因素應仔細檢查。 應當重申通過整個顯微鏡透射通過所有的光學元件的透射率確定產品。

照明亮度

在顯微鏡配備了一個很好的校正光源(包括聚光透鏡係統)和聚光透鏡,光照程度( 照度 )Kö柯勒照明條件下的場是由許多因素包括固有亮度(平均 光密度 )的光源和焦距為光源的聚光透鏡的。 此外,的聚光透鏡係統的數值孔徑,孔徑光闌的聚光鏡的開口大小的設置,和整體 透光率 照明係統的幫助控製照明度。

Köhler照明下,光從一點發出的源均勻照亮的顯微鏡視場光闌產生明亮的均勻照明領域(取決於光源的性質)。 因此,在該領域的膜片的開口的大小隻影響照明領域的直徑而不是它的亮度。

所選光源發光密度
電流
(安培)
發光的
通量
(流明)
平均發光
密度(CD/mm 2
圓弧尺寸
(H×W)
(毫米)
汞燈
(100W)
5 2200 1700 0.25×0.25
氙燈
(75W)
5.4 850 400 0.25×0.50
氙燈
(500W)
30 9000 3500 0.30×0.30
鹵鎢燈 8 2800 45 4.2×2.3
表2

提供的聚光透鏡焦距並非縮短項物鏡源,包括聚光鏡光圈整個打開一個圖像,采集的電源,或 F 價值(直徑/焦距)的鏡頭不影響現場照度。 該光源和聚光鏡數值孔徑的平方確定場地的照度平均光密度,提供電容虹膜開口中填充了光源的圖像。 收集電力的聚光透鏡和光源的大小影響場照度僅當源圖像不會覆蓋整個聚光鏡孔徑。

總之,平均光密度(每單位麵積的光源的光輸出)確定圖像的亮度,而不是總的光輸出量,光通量,或光源麵積。 從光源光通量的光密度和源區的產品,後者隻起到次要的角色,在確定的平均光密度。 由於源的發光密度限定範圍的照度,圖像的亮度不超過光源的光密度。 換句話說,現場不能比源明亮,無論多麽聰明的安排和組合鏡,棱鏡,透鏡,或其他部件的光學列車。 表2列出了幾種照明光源,具有相對高的光密度,光學顯微鏡是有用的,包括規格如光通量的大小,弧,和平均光密度。

應當指出的是,許多集中(汞和氙弧燈)提供了一個非常高的程度的光密度,並在電弧的光分布極不均勻度。 通常,電弧是在相鄰的一個電極點亮一分鍾,即使在弧的整體尺寸小(0.3×0.3毫米低)。 當這樣的電弧圖像投影到聚光鏡孔徑,不再有照度均勻分布。 因此,在試樣各點所產生的衍射圖案偏離理想的通風盤。 然而,這些弧燈顯微鏡的某些應用程序是必不可少的(主要是因為高熒光) 的意思是 光密度。 這種情況的一個補救方法是采用一個單一的光學纖維(不是一個纖維束)光器可以添加到顯微鏡沒有明顯損失的平均照度。 圖8說明了熒光圖像的物鏡後焦平麵在一個情況下,現場照明不均勻,由於光照強度分布不均勻。 圖8(a)標本的圖像被均勻地照射,將項物鏡一個可接受的圖像到傳感器。 相反,在圖8(b),試樣不正常照明整個視場,會導致在一個顯著的程度的強度波動圖像。

顯微鏡聚光器是在確定的質量和提供的照明度的一個關鍵要素的標本。 一些顯微鏡聚光鏡可以采用無聚光鏡頂部透鏡和物鏡前透鏡之間的浸沒介質。 更經常的,高質量的聚光鏡設計用於與一個特定的浸沒介質,具有特定的折射率和色散。 介質,可油,甘油,水,空氣,使凝汽器頂部的透鏡元件和試樣的上下表麵之間的空間。

多數暗視野,和一些相對比,微分幹涉對比(DIC),和偏振光光學要求聚光鏡是沉浸為了實現高凝汽器數值孔徑。 凝汽器是專為最佳性能和最小像差時正確的浸泡介質具有定義的折射率和色散是利用。 浸泡省去了光的損失超過了臨界角,消除了額外的折射,反射光的損失最小化,並減少光學接口,或反映在高入射角的散射光的數量。 這種散射和反射成為一個來源的火炬,並改變光的偏振狀態,從而減少高數值孔徑的光學係統中的偏振消光。 總之,聚光鏡的浸沒影響場照度以及圖像的質量。 為了實現最佳性能,設計為沉浸式聚光鏡應沉浸與正確的介質。

雖然該領域的照度與聚光鏡的數值孔徑的平方增加,打開聚光鏡光圈太遠物鏡數值孔徑的匹配產生耀斑。 此外,該照明,錯過物鏡孔部分產生的暗視場圖像疊加在明場圖像,從而降低圖像的對比度。

結論

該地區暴露在一個視頻傳感器或膠片平麵中的光學顯微鏡對放大率的平方成比例,如以上所討論的。 因此,圖像的亮度的減小放大廣場。 在一般情況下,顯微鏡用於暴露的細節在一個標本,但與此同時,顯微鏡是一種有效的集光儀。 正如望遠鏡或雙提高我在夜間的異象,顯微鏡的聚光能力,可以有效地捕捉照亮物體的影像。

根據樣品必須是可視化的特點,圖像可能會變得更加有意義,如果更多的光的收集,而不是提高放大倍數。 對於一些發光和熒光標本,光水平可能會很低,高度放大的圖像變成看不見的或檢測不到,因此毫無意義。 在這種情況下,圖像可以通過集成的光在時間收集更多的光線,更清晰的(如果試樣是靜態的),或通過降低圖像的放大率。

在非常低光水平的情況下,可以用最高的數值孔徑物鏡可在最低的總放大倍數最大化圖像亮度。 在某些情況下,它是用眼去減少甚至是有益的,而不是增加,中間圖像的放大倍率。

為了配合傳感器分辨率的物鏡分辨能力,有一個總的趨勢,提高放大的圖像投射到CCD傳感器或視頻攝像裝置。 由於圖像的亮度下降的放大和傳感器方隻能在限定範圍內的強度函數,增加放大會導致亮度水平低於傳感器的靈敏度。 如果試樣被固定或變化非常緩慢,信噪比可以通過集成的圖像在幾個幀時間顯著改善,通過求和或平均信號,或者更好的是,通過在傳感器本身集成光電子。 在這種情況下,時間分辨率的提高空間信息的犧牲。 不管如何,往往有一個拔河,和妥協,試圖提高分辨率並試圖降低噪音水平之間的急劇上升,作為圖像變得暗淡。 當亮度的圖像是有限的,其技術人員必須仔細調整儀器放大取得最好的平衡。



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