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尼康顯微鏡減少光暈與變跡相襯

2014-09-26  發布者:admin 

  光的吸收差異往往是在活細胞內的各種細胞內的成分和質膜之間可以忽略不計,使他們幾乎不可見的觀察時,利用明場照明的經典技術的顯微鏡。 相差顯微鏡利用微小的折射率的差異在細胞成分和未染色的細胞和其周圍的水溶液中,在這些和類似的透明標本產生的對比。

光通過 環孔 ,安裝在聚光器焦平麵,用以照亮在常規相襯顯微鏡標本(圖1)。 為空心圓錐體發出的光相環遭遇透明標本,它是經亞細胞成分和膜或通過非偏移。 光穿過標本非偏移到戒指形狀的物鏡的後焦平麵,而微弱光標本衍射分布在焦平麵上的整個表麵。 一個小的相移約四分之一波長相對於光直接測量在光誘導的試樣衍射。

相位差的光直接從背景和衍射光從樣品使兩束光互相幹涉在中間圖像平麵。 這是通過添加或減去一個四分之一波長轉移到直接的光的半透明的相位板放置在一個平麵,共軛手段達到(物鏡後焦平麵)的環在聚光鏡(聚光鏡前焦平麵)。 直接的背景光是由一個中性密度薄膜的物鏡相環采用衰減。 在中間圖像平麵,一個幹涉圖案的結果,產生強度由樣品引起的相位偏移的比例。

 

在相差顯微鏡一個不幸的工件是 光環效應 其結果,在虛假的亮區周圍的物體或反相位圖像中的對比度。 這種效果是特別普遍的標本,產生大的相移。 暈工件減少曾經被認為是一個理論難題,但物鏡相環結構的最新進展已經導致了一種新的技術稱為 變跡相對比 (圖2),它允許有大的相位差來查看和拍攝的高清晰度和細節的定義相對象結構。

圖2給出了一個傳統的(或經典)和變跡相板定位在一個角度觀察切片通過為了便於說明中心。 左邊的經典相位板,位於物鏡後焦麵,有一個薄環的中性密度材料(稱為相位膜)應用於表麵(圖1也說明)。 這部電影的物鏡是延緩直接光線透過標本由四分之一波長允許建設與衍射光在中間圖像平麵的幹擾和破壞階段。 圖2右邊的是一個變跡相板圖。 在這個板塊的周邊相膜是半透明的中性密度材料的兩個同心區域,減少從樣品在小角度衍射光的強度。 變跡相差顯微鏡,這相位板取代了板在物鏡後孔左。

變跡相板在顯微鏡下看到的圖像效果如圖3所示為兩個標本。 圖3(a)是一個照片的海星胚胎與尼康 顯微鏡 Eclipse E600相襯模式操作標準。 其物鏡是使用長工作距離( 隨鑽測井 PH1 DL (明暗)設計生產上的淺灰色背景暗圖像的輪廓。 這種類型的物鏡是用於細胞和其他生物材料的常規相對比檢查最流行的類型,因為它具有折射率的差異主要對象產生了強烈的明暗對比。 注意周圍的胚胎的外周和對比度和圖像細節的細胞團中央部分缺失的光環。 一個顯著的改善對比度是一個具有切趾相位板相應的物鏡觀察使用,如圖3所示(B)。 在這張圖中,海星胚胎有顯著減少暈周圍和具有鋒利的邊緣增強的內部樣本的細節和明顯的景深。

一雙類似的照片是在圖3所示(C)和3(D),用活眼蟲標本。 眼蟲屬的原生動物順序Euglenida成員,單細胞生物的一個顯著的組,其中許多展品的植物和動物的特征。 圖3(c)提出了一個經典的相位對比圖像的眼蟲標本采用DL階段物鏡。 內部樣本的細節有一個模糊的對比度和外細胞膜包圍的巨大光環。 當同一標本采用變跡相光學(圖3(d)),減少暈的大小和內部樣本特征更高分辨。

變跡相對比理論

折射率( N )大多數位相物體,尤其是活細胞,範圍1.36和1.37之間的照射時,具有平均波長的光集中在可見光譜區(550納米)。 有一個球形的幾何形狀的試樣,試樣和周圍介質隨試樣厚度的增加之間的相位差,導致偏離的標本的光一個較小的衍射角。 假設一個球形試樣,最大相位差(δ)和直徑( D )由以下方程

(1)
δ = (2Π/λ)(n' - n)d

在λ是光在真空中的波長(或空氣), N’ 是樣品的折射率,和 N 是周圍介質的折射率(通常是一個緩衝水溶液)。 這是明顯的從方程,增加試樣的直徑( D )將非法相應較大的相位差(δ)在照明的波前,提供的樣品和媒體的折射率保持不變。

現在,AG亚游集团將考慮的圓孔直徑產生的衍射圖案 D 在理想的情況下,當物鏡是無像差和提供了一個統一的圓孔,相鄰的兩個點是解決當他們通風盤中心的距離 R ,中央艾裏斑半徑。 數量 R 由方程確定

(2)
r = 0.61λ/n(sin(Θ))

在λ是光與空氣的波長作為浸介質和θ是衍射角(角度)。 在這個討論中,AG亚游集团假設孔徑 D 等於分辨率的距離 R ,然後能狀態

(3)
r = d = 0.61λ/n(sin(θ))

該重排

(4)
sin(θ) = 0.61λ/nd

代入方程(1)為方程(4)的收益率

(5)
sin(θ) = (2π/λ)(n' - n)0.61λ/nδ

 

(6)
sin(θ) = 2π(n' - n)0.61/nδ

如果衍射角(θ)是小的,然後是長期之間的反比關係 sin(θ) 和相位差(δ)

(7)
sin(θ) ∝ 1/δ

為了研究衍射和非偏移光強度在中間圖像平麵上,AG亚游集团必須首先考慮照明波前的物理方麵。 如果照明波前均勻平麵波入射波前,然後(φ(0))和波前通過相位物體後(φ試樣;(1))可以由以下方程描述

(8)
φ(0) = sin(ωt)

 

(9)
φ(1) = sin(ωt + δ)

在ω為照明波前角頻率, T 是時間,和δ通過標本或通過周圍介質的波陣麵之間的相對相位差。 在大多數情況下,δ小的價值,所以,方程(9)降低

(10)
φ(1) = sin(ωt) + δcos(ωt)

方程中的第一項(10)描述了入射光波(方程(8))和代表衍射或直接光通過和周圍的標本,而第二個術語表明筆由標本衍射的光線。 在大多數情況下,衍射光有一個四分之一波長的相位差相對於直接光,和幅度,是由樣品引起的相位差成比例的。 考慮到加(或減)的四分之一波長的光的直接部分通過一個適當的分區相位板的使用物鏡後焦平麵,方程(10)降低

(11)
φ(1)=(1 +δ)cos(ωT)

到達強度( I )在中間圖像平麵波,AG亚游集团可以把方程的平方(11)將刪除時間依賴性

(12)
I = (1 + δ)2

圖像強度成正比 (1 +δ) 2 因為平方餘弦積分常數。 因此,衍射角之間的關係,通過試樣的衍射光的振幅和相位的差異,建立了。 從方程(12),這是明顯的,在中間圖像平麵上的光的強度是在直接的振幅總和的比例和衍射光。 應當指出的是,衍射光的強度和位置的變化,而光領域,直接在圖像平麵均勻。

變跡相板

在實踐中,暈還原和試樣的對比度的增加,可以通過選擇性的幅度利用獲得的過濾器位於建成的物鏡在後焦平麵的相位板相位膜相鄰。 這些振幅過濾器包括中性密度濾光片薄膜應用於周圍的相片如圖2所示的相位板。 的相移圈在經典的相位板的透過率約為百分之25,而相鄰的環周圍的相移圈在切趾板對有透射率為百分之50的中性密度。 在兩個板的相薄膜的寬度是一樣的。 這些值的相移薄膜應用於相襯顯微鏡標準板的透射率值一致。

周圍的中性密度薄膜可由衍射角計算出必要的寬度(θ),討論了方程(2)通過(7)。 這個值是有些標本的依賴,但商業變跡相物鏡可以從尼康製作假設一個對象(樣本)約10微米的直徑,用於組織培養實驗生物細胞的典型值。

在圖4中給出了變跡相位對比技術的基本原理,說明了小型和大型標本的影響。 之間的關係在不同尺寸的試樣的相位差,嚴重影響變跡相板衰減的影響。 光的衍射的較大的標本慷慨的一部分(大於或等於10微米的直徑;圖4(a))通過中性密度吸收環和將被衰減,從而降低強度。 另一方麵,標本,直徑小於10微米,如核仁,細胞膜,細胞質顆粒,衍射光會通過對中性密度過濾器的外周由於大的衍射角。 在這種情況下,衍射光的振幅將不會通過相位板的透明部分的衰減,在高對比度細節渲染標本(但伴有暈)。

切趾技術已與其他的光學配置成功地用於減少在孔直接光強度。 在任何衍射極限的成像係統的點擴散函數,通常有側裂片或顯著的強度側環。 這些文物可以設計解決弱點光源位於相鄰的一個強大的點源係統相當的關注。 術語 切趾 來自希臘詞“清除腳”。 在光學方麵,“腳”被認為是在一個有限的衍射成像係統的側裂片或側環。 類似的技術,在數字成像中常用的術語,是已知的 窗口

一般來說,一個光學係統的變跡要求振幅衰減的介紹(或在某些情況下,增強)光通過出瞳。 的衰減量在瞳孔的中心通常是可以忽略的,但與半徑的增加而增加,成為最大的在附近的孔徑瞳孔邊緣。 換句話說,在孔徑圖像的邊緣可以“軟化”的光衰減麵膜的介紹。 因為在邊緣波起源於邊緣突然孔徑衍射的結果,軟化效應有助於傳播的衍射波明顯起源地區較廣。 這個結果在抑製振鈴效應的邊緣波。

切趾的經典被用來提供一個逐漸變細的透射率接近光通過為光學係統的出瞳來抑製旁瓣的周圍的點擴散函數的邊緣強度。 然而近年來,切趾,已經應用到其他係統,用來描述任何引進吸收入瞳,無論旁瓣抑製或雜音。

總之,變跡相對比的結果在顯著提高光學圖像的利用率,減少了暈和微小的標本細節對比度高。 在大多數情況下,亞細胞的功能(如核仁)可以明確區分為暗對比與已切趾的物鏡,但這些特點有明亮的光環或成像為亮點,使用傳統的相位對比光學。 與切趾光學,對比是扭轉由於衍射光的相對大的振幅,直接光線透過標本。

從相位物體圖像的對比度可以通過調整透光率和環形中性密度區圍繞中心相薄膜尺寸的改變。 如果這些區域與梯度的透射率產生,然後對象的對比可以為各種不同的試樣尺寸更緊密的控製。


 



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