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奧林巴斯顯微鏡全內反射的基本結構

2014-09-26  發布者:admin 

光學結構的寬光譜劃歸審議過程中儀器開發的全內反射熒光顯微鏡檢查(TIRFM)的早期階段。從這一努力出現一個數字,滿足在不同折射率的兩種材料之間的接合處產生的薄漸逝場的要求設計的。

在倒置顯微鏡下為這些設計的大部分,主要是由於添加TIRFM光學上的方便,而不是下麵,笨重的顯微鏡台。 立式顯微鏡的結構也可以利用,尤其是當這是唯一可行的選擇,實驗條件或調查員的預算。 與生長的細胞在單層培養在塑料培養皿底細胞基質接觸的觀察是一種直立顯微鏡很好的候選人,尤其是當與浸漬的錐體采用水浸的物鏡。 倒置顯微鏡更有效時,檢查細胞或膜組件連接到一個密封的標本室上部或當物鏡是用來照亮和檢索從試樣的二次熒光發射。

無論基本的顯微鏡的設計,大多數目前使用的TIRFM結構依賴增加棱鏡激光直接光照往何處發生全內反射界麵,這是樣品中的共聚焦平麵的顯微鏡。 也可以用顯微鏡物鏡的同時直接照射到接口和實現第二熒光發射的激發熒光基團產生。 本文討論了許多的TIRFM基本的顯微鏡的結構,並假定例標本是在組織培養中的一個或多個熒光染料標記,在單層附著在玻璃蓋玻片在全內反射界麵生長的細胞。

圖1中給出的是一個典型的TIRFM儀器結構涉及一個倒置的組織培養顯微鏡,梯形棱鏡塊,外加激光照明,和一個光電倍增管/ CCD探測器係統的組合。 發出的激光經過先擴束後成一個分束器將顯微鏡入口端口和梁主任鏡之間的淡藍色的光。 在導演的鏡麵反射,光的一部分被聚焦透鏡到梯形棱鏡放置在顯微鏡載物台上方的標本室和物鏡集中。 棱鏡把光照在一個角度,略大於內部全反射的臨界角的TIRF接口,創建一個漸逝場激發熒光的樣品。 光的分束器通過另一部分進入顯微鏡的港口,在那裏它可以被引導通過光培養寬視場落射熒光激發試樣。 二次熒光的樣品發射的物鏡是收集並傳遞到目鏡的CCD攝像係統,光電倍增管(PMT),或。 由於梯形棱鏡的頂是平的,從鎢鹵素光源照明可以用來觀察樣品在透射模式使用一係列的對比增強技術,包括微分幹涉相襯,相對比,暗視野,和霍夫曼調製對比度。

當設計TIRFM實驗,在構型的主題考慮的最重要的因素是照明的臨界角。 普通的玻璃蓋玻片上,在組織培養細胞通常生長,有約1.52的折射率的介質時,周圍的細胞和細胞內成分的折射率的範圍從1.33到1.38。 因此,在細胞膜和蓋玻片之間的接口獲得全內反射( N(2)/n(1) =1.52/1.38),入射角必須大於65度的臨界角。 如果細胞是不完整的和已透,溶血,超聲處理,或固定,然後低折射率的水性緩衝液( N(1) = 1.33)而不是細胞質,和臨界入射角度減少到61度。

奧林巴斯顯微鏡在原則上,可以采用傳統的鹵鎢或汞/氙弧燈進行技術試驗,但大多數的文獻報道的調查是在激光照射下進行。 激光器是如此廣泛的首選的最主要的原因是,激光是相幹光,偏振,和準直,這樣就可以很容易地引導到物鏡或棱鏡擴束鏡,使用標準,和聚焦透鏡。 當激光源是正確對齊,全內反射界麵被定義的幾何形狀,可以很容易地調整,以適應變化的區域試驗。 高強度的激光源,也為實驗要求的照明相當重要,如熒光漂白後恢複(FRAP)的調查和熒光比率測定。

為tirmf實驗最流行的激光源是1至3瓦的空氣和水冷卻的連續波氬離子係統,在488和514納米,具有很強的發射線,提供廣泛的普通熒光激發的能力。 在較長的波長具有線激光器,如氦、氖、氪離子氣體激光器,可用於激發熒光團的吸收在540納米和較高的地區。 然而,幾乎所有的激光在0.5瓦的總可見輸出或更大的範圍應該足夠了。 激光源是一般可取為TIRFM弧燈,因為在強度嚴重降低電弧燈發出的光準直的結果。 然而,激光照射有不可避免的幹擾邊緣上的試樣,可以通過精心清洗光學表麵有所降低。 臨界實驗,研究者應該探索快速抖動的激光束,或至少計算一個正常的使用由一個均勻的熒光團的濃度控製的數字圖像樣本的數字圖像。

倒置顯微鏡的結構

為了實現在倒置顯微鏡下培養室全內反射的激光直接照射在玻璃立方體放置在腔室頂部的最簡單的方法,如圖2所示。 在一般情況下,一個固定的顯微鏡(物鏡轉盤/物鏡組合是翻譯在聚焦)比移動台顯微鏡更方便。 這種結構使試件將聚焦的過程中保持靜止,隻需要對激光束的初始對準。 然而,移動台顯微鏡是更常見的,兩種類型可用於這些實驗。

在倒置顯微鏡的結構被認為是在這裏,緩衝區填充的樣品室由一個較低的赤裸的蓋玻片,60微米厚的聚四氟乙烯墊片環,和細胞粘附蓋玻片倒使細胞的臉朝向物鏡。 這種設計的優點是細胞沒有綁定到基板,鬆散的細胞碎片,和汙染蛋白傾向於沉積物作為一個集合到室底無遮蔽或添加外源熒光全內反射界麵。

單層細胞的蓋玻片組合的上表麵被放置在與玻璃塊光接觸(或棱鏡)由一層薄薄的浸油或甘油的方法。 玻璃塊的側麵應固定,但樣品必須能夠接受的翻譯在x和y方向的同時仍然保持光學接觸。 下蓋可以過大和聚四氟乙烯墊片通常是有差距,緩衝溶液浸泡的細胞可通過毛細管作用具有入口和出口端口(圖2和圖3)。 一些製造商提供的組織培養室是專為這個物鏡。

如圖2所示,激光光束首先進入一個聚焦透鏡傾斜放置在顯微鏡載物台。 鏡頭的物鏡是將激光照射在幾乎相同的方式,作為一個物鏡在EPI照明,但鏡頭也更容易對準的窄波束寬度。 透鏡的焦距是不重要的,50和100毫米之間的範圍,但應允許研究者很容易改變照明麵積的大小在一個狹窄的範圍內。 在照明係統其他組件,聚焦透鏡應安裝在一個軸與入射激光束方向對準X-Y-Z翻譯。 譯者可以安裝在實驗室的工作台上或顯微鏡的階段,但會更容易使當它被安裝在舞台上。

三個主要的光學元件和直接控製激光束的大小和途徑進入聚焦透鏡之前(見圖1)。 這些包括擴束器拓寬激光光束在退出腔,一個分束器(可選)或反射鏡,和一個光束導演將光束聚焦到聚焦透鏡。

激光光束擴展器的廣泛可用一些經銷商,並用於在聚焦透鏡的光束寬度控製。 作為一個結果,然後通過聚焦透鏡確定收斂到樣品與焦斑寬度角。 激光光折射在一係列的光束角遇到的立方體的垂直麵時。 由此產生的幾何畸變的界麵處產生一個橢圓的照射區域,這是拉長時相比,一個高斯分布的平行光束的預期模式。 梁是更大的當他們進入聚焦透鏡產生具有較薄的尺寸反射點。 在最佳條件下,梁的半寬度接近下限可以達到2.5μm。

分束器是一麵鏡子,把水平激光束在垂直方向(90度角)來提升它的過去的高度的顯微鏡載物台和玻璃棱鏡或塊。 一個可調節的光學安裝應該用來房子分束器可移除以允許激光直接進入一個快速和可逆轉換為輔助外延照明顯微鏡端口。 利用部分鍍銀鏡或甚至一個普通的載玻片作為分束器,兩個落射照明和全內反射可以同時查看。

梁主任鏡采用角的激光束從垂直方向斜向聚焦透鏡(見圖1)。 鏡子高度在全內反射麵確定入射角。 除了線性調節高度,導演鏡子應該裝在一個雙軸旋轉安裝允許的未聚焦的激光束方向進入棱鏡。 如果鏡像安裝連接到移動台顯微鏡階段(而不是實驗室),的反射區的位置可以被聚焦時,試樣的變化不敏感。

正確對齊時,準直和聚焦的激光束進入玻璃立方體,而導演折射罷工的全內反射界麵(在立方體的下表麵)與入射角超過臨界最小。 無論是規模還是的立方體形狀是至關重要的,和棱鏡或長方形的玻璃塊可以很容易地取代。 等邊45-45-90-degree棱鏡是標準的商業項目,可以從各種來源購買。 一個平頂棱鏡(圖2和圖4),如立方體上麵或截斷的三角形,使鹵鎢燈和聚光係統在棱鏡安置。 在這種結構中,傳統照明技術如明場,暗場,相襯,和微分幹涉對比可以耦合TIRFM調查協助確定的熒光源於界麵的空間位置。

安裝的棱鏡或玻璃塊,將一滴純甘油或浸油的文化室的上表麵和棱鏡慢慢降低到油麵,從而傳播的液滴成薄薄的一層。 接觸媒體(甘油或油)有兩個物鏡:保證棱鏡和樣品室之間的光學接觸,和機械潤滑區的兩個玻璃表麵之間。 隨著標本室側翻譯在掃描過程中,棱鏡或玻璃塊是固定的。 入射的激光束傳播通過棱鏡的斜下方,然後通過甘油或油層,最後通過試樣,完全反映在基板的底麵直接在顯微鏡的光軸。 基板的厚度是不重要的,除了厚的基板(那些接近一個毫米甚至更多)可能會限製激光束從會議的底麵直接在顯微鏡的光學軸。

浸泡接觸的介質(油或甘油)應謹慎使用,因為任何多餘的可能積聚在棱鏡的下邊緣和幹擾入射激光照明時,首先進入玻璃。 棱鏡的大小並不重要,但是大棱鏡可以抑製試樣的橫向運動,雖然會增加浸泡介質珠和入射光束之間的間隙。 一般來說,一個棱鏡或玻璃塊與約一平方厘米麵積是理想的。

棱鏡采用幾個令人興奮的激光係統不需要在折射率精確匹配的幻燈片或蓋玻片中發生全內反射。 他們可能與甘油,環己醇的光耦合,或顯微鏡浸油,其他光不同的液體。 浸沒油具有較高的折射率,這有助於避免在棱鏡/耦合在低入射角的媒體接口可能全內反射。 然而,許多品牌的浸油表明自體熒光顯著量。 另外重要的一點是,截斷棱鏡表麵不需要特殊的拋光處理,但與一個標準的商業顯微鏡載玻片平滑充分履行。

幾個樣品室的設計,利用由玻璃和/或蓋玻片窗口如圖3所示。 左側(圖3(a))是一個 塔姆 室內設計提供一種薄的輪廓,使組織培養的細胞是通過一層薄的緩衝溶液中觀察到的,它允許高數值孔徑的物鏡有很短的焦距的使用。 一個單層的細胞上生長,蓋玻片(或顯微鏡),是從一個具有厚度小於100微米的薄墊片下蓋玻片分離。 接入孔,使細胞與各種各樣的溶液進行滴定灌流,平衡結合實驗,或在細胞表麵相互作用的動力學分析。 一個類似的裝置,該 德沃夏克史托勒 控製的環境中培養室,是說明了在圖4(b)。 該室還利用蓋玻片兩個頂部和底部的窗口,但不能訪問孔或任何機製來允許添加化學品或緩衝溶液的變化。

如圖3所示,標本室包含必要的維持培養細胞的水性緩衝液。 這個解決方案是夾在襯底表麵和蓋玻片之間,相隔一氯丁橡膠或聚四氟乙烯墊片。 聚四氟乙烯環是市售的,具有的厚度範圍從50微米以上。 緩衝溶液的深度必須相當薄,如果高放大倍率的物鏡具有大的數值孔徑和短的工作距離是被雇用。 在許多情況下,該玻璃棱鏡在基板上的向下的壓力可能是適當的密封樣品室無附加卡,但許多室內設計(圖3)包括安全機製的基板和玻璃蓋玻片。

在情況下,一個棱鏡法(而不是一塊玻璃)實現全內反射(見圖4(a)),最大入射角是通過引入激光束從水平方向上得到的。 標準玻璃(有1.52個折射率),最大入射角為73度的直角棱鏡和79度的等邊棱鏡。 由於三角棱鏡上表麵不平坦的相位對比度和其他的透射光技術不采用這種結構兼容。 然而,自定義截斷和棱鏡的頂拋光(顯示如圖4一個選項(A))產生的表麵,可以很容易地通過入射的光從上麵通過倒置顯微鏡聚光係統。

安裝在顯微鏡聚光鏡單元時,一個60度的梯形棱鏡(圖4(b))是最方便和可重複配置開發的TIRFM以上倒儀器階段。 入射的激光束是垂直的,所以全內反射麵積變化的橫向一個很小的程度時,棱鏡提高和relowered在試樣的變化。 此外,傳統的透射光技術(相對比,明暗,等)與本實驗設計兼容。 由於入射角固定為60度(1.52,普通光學玻璃的折射率)是不能夠支持全內反射,並具有高折射率棱鏡是必需的。 用燧石玻璃製成的棱鏡(折射率為1.64)將符合這些要求,與市售。 光束將折射遠離正常的從通過棱鏡到蓋玻片的69度的角度,從而超過臨界角在蓋玻片/緩衝或蓋玻片/細胞界麵。 與牆為45和60度之間的梯形是理想的,但這些單位是不容易的,必須生產出定製規格。 不幸的是,45或60度的梯形也沒有市售,但他們可以通過截斷和拋光的市售的三角棱鏡的頂點的廉價生產。

圖5給出了四分之一的結構利用一個拋物麵反射鏡和半球形棱鏡進行倒置顯微鏡實驗。 在本設計中,反射鏡和棱鏡的位置使激光束穿過一個半徑的棱鏡對全內反射靶區在凹麵鏡的焦點。 因為光線進入棱鏡幾乎正常在所有的入射角在臉上,光束輪廓的像差相比,與一個立方體或矩形棱柱塊所觀察到的減少。 在垂直入射激光束的橫向偏移能總是把焦點放在同一個地方,使大量的、方便的改變光線入射角。 此外,在漸逝場的幹涉條紋,可以通過將輸入光束分成兩個組件創建的,每個反射在拋物線一個單獨的方位角位置,但重組在拋物麵焦點。 條紋間距可以通過調整兩個入射光束的相對方位角位置的變化,和非常高的空間頻率可以達到。 幹涉條紋,可以作為一種輔助聚焦的接口上創建一個平行線的幹涉條紋圖案。 這一模式可以在細胞/襯底接觸的區域觀察到的,這證實了激勵源的倏逝場(而不是通過細胞場隨機散射光)。 幹擾模式也是有用的在表麵的擴散速率的研究來衡量的接觸區域的膜元件的橫向流動。 盡管這個設計的通用性(圖5),定位是非常困難的,該係統是更敏感的振動。

倒置顯微鏡結構審查這裏都有一些優點和缺點。 主要的優點是能夠利用而廉價的光學顯微鏡工作台上有足夠的空間位置的試樣和玻璃塊/棱鏡和支撐光學元件。 此外,棱鏡可以安裝在聚光鏡支架(安置在現代倒置顯微鏡階段)在升降自如,並與傳統的光學技術輔助觀察。 最後,這些光學安排享受簡單設計和最容易對準的全內反射係統。

倒置顯微鏡的結構主要缺點之一是事實,標本不易從上麵和常規照明由棱鏡先端阻礙訪問。 同時,最短的工作距離的物鏡不可能達到聚焦在緩衝層,並具有高數值孔徑的物鏡圖像質量的降低由於球麵像差時,觀察樣品在較厚的緩衝層。

棱鏡或玻璃塊對齊的倒置顯微鏡光學係統涉及到對全內反射區直接在物鏡而試樣在焦點。 第一步是將樣品室和棱鏡組合,然後將試件在使用明場照明的重點(甚至在棱鏡的頂點是存在的)。 接下來,用激光聚焦透鏡的光束直接刪除,以便它經過的物鏡前透鏡中心的全內反射。 這可以通過直接觀察(不通過顯微鏡目鏡)用於散射入射光在棱鏡,浸層,和基板。 重新插入聚焦透鏡後聚焦的激光束,使進入棱鏡側麵大約一毫米的底部邊緣以上調整其位置。 直接觀看梁應在棱鏡底部顯示的散射光三共線性點:兩個在外麵,光束通過浸漬層,和一個中央地方的光束經過在試樣內部全反射。 聚焦透鏡應調整中間點是可見的細長圓柱麵。 和全內反射區域大小的位置可以用聚焦透鏡的翻譯和移動透鏡的縱向優化照明區域的尺寸調整。

的全內反射區的形狀依賴的棱鏡或玻璃塊側表麵的取向,在激光束進入。 如果一邊是垂直的(如在一塊或矩形),該地區將長到一定程度,是一個電子束會聚功能。 正如前麵所討論的,延伸率是由於像差的大折射角度首先介紹了棱鏡表麵或玻璃塊。 另一方麵,如果側麵傾斜使準直的激光束進入一個角度接近垂直,然後反射區會像一個小的細長的圓錐形部分,預計從切片的圓柱形束在一個角。

在所有上述的光學結構,照亮的區域將保持平穩的視場中心作為試樣在橫向尺寸掃描。 然而,當顯微鏡階段期間移動焦點,照亮的區域可以橫向移動作為樣本集中,取決於是否聚焦透鏡和光束的導演都安裝在實驗室的工作台上或顯微鏡階段。

全內反射點的重點應不大於視場寬度。 如果現場太大,假散射和離焦熒光從棱鏡和蓋玻片之間的浸油層會增加其他熒光背景低,可能與全內反射熒光顯微鏡。 另一個工件時的入射角非常接近臨界最小,表現為沿界麵的表麵細胞明顯的陰影。 這可以通過一定的入射角超過臨界角數度,避免。

當入射角接近臨界值,有時很難確定是否已經實現了全內反射。 在這種情況下,通過顯微鏡目鏡觀察熒光強度常可幫助研究者確定儀器的正確結構。 從TIRF界麵熒光發射是從由入射光束在亞臨界“略讀”的角度通過緩衝水傳播的激發截然不同。 因為倏逝波(不像光束傳播)是遠小於的重點物鏡深度,熒光似乎來源於由全內反射的激發單平麵。 相反,落射照明(從亞臨界梁)激發熒光團在標本室和二次熒光大部分是在很寬的範圍內的焦平麵的觀察。

局部定性強度測量在總的內部反射的實驗,這可能是可取的限製區,從收集的發射光。 經常被照射區域是不可能很小,但確定的表麵積可以通過一個可調光闌放置在發射光通路的圖像平麵上獲得。

另外幾個TIRFM結構涉及倒置顯微鏡已被聘用的人員。 該係統如圖6所示提供了另一個係統,固定棱鏡相對於試樣代替激光束。 雷射光從右邊進入通過一個入口的棱鏡,並折射到基板上傳播朝向顯微鏡光軸通過多次內部反射。 一路上,多重反射光束遇到標本(組織培養細胞粘附在玻璃蓋玻片)說明了發色團在玻璃/緩衝界麵區。 通過試件和基板後,反射光束進入射棱鏡,它將光從實驗。 在這種結構中,光照反射區將試樣時,翻譯。

一個更有用的結構,是兼容的同時注射或膜片鉗實驗,如圖7所示。 為了提供從上麵一個組織文化沐浴在緩衝容易和連續訪問,棱鏡是部署下階段接觸玻璃基板。 這種結構,不可用於所有倒置顯微鏡,受到嚴密的幾何因為物鏡也居住在鄰近地區。 如係統如圖6所示,台下的棱鏡啟動多個總的內部反射在蓋玻片,這將激勵光波導的遠軸的視場的中心。

在最簡單的形式中,一個小三角棱鏡(商用)放置,通過浸泡油或甘油,與含有細胞和緩衝液蓋底光接觸。 樣品可以翻譯而棱鏡保持橫向固定,雖然塗抹油可以在蓋玻片可以摧毀第一反射下側左(實驗)。 一個可行的方法是使用一個額外的幹預蓋玻片與光學透明膠固定到棱鏡。 滑動運動發生的幹預和細胞的蓋玻片蓋玻片之間,這是光學接觸,由一層薄薄的潤滑油或甘油浸泡。 這種結構的一個主要缺點是,油或甘油浸漬物鏡無法使用,因為浸泡介質可能會破壞內部反射照明斑的形成之前。 然而,空氣(幹)或水浸的物鏡很好地工作在這種情況下。

直立顯微鏡結構

梯形棱鏡,類似於圖4所示(B),可以安裝在聚光鏡支架在直立顯微鏡在位於階段標本全內反射界麵觀察現象(圖8)。 擴展的激光束被引入到顯微鏡基地使用用於發射光源相同的端口(這應該被刪除)。 一個長的焦距(約250毫米)會聚透鏡放在門口附近的港口和安裝在X-Y翻譯用於聚焦入射激光束和允許的橫向位置微調。 激光準直照明可以利用顯微鏡內置的光學列車直梁通過底座和垂直向上進入棱鏡。 一個額外的鏡頭位置略高於顯微鏡基礎往往是翻譯和焦點的全內反射點有用的。 這種結構不調整入射角提供了很大的靈活性,但有限的範圍內的值可以通過使用具有不同的角的幾何形狀和折射率達到幾個梯形。 圖像是通過冷卻科學CCD數碼相機在圖5所示的收集,但一個光電倍增管或雪崩光電二極管可以很容易地取代。

棱鏡玻璃折射率的選擇是有限的要求,用火石玻璃(折射率為1.62)是優選的配方。 一個60度的入射角,棱鏡的折射率必須至少1.53為全內反射發生在玻璃/水界麵(無論基板材料)。 這就是為什麽火石玻璃,而不是普通的光(皇冠)玻璃或石英,是這些實驗的理想的棱鏡材料。

照明光被反射到棱鏡的顯微鏡鏡下,並透過玻璃折射棱鏡的角邊。 因為梯形棱鏡將自定義尺寸沒有市售,菱形截麵是由截斷和拋光觸手可及的等邊三角形的棱鏡上製作。 聚焦透鏡後的激光軌跡定位,這是調整的傾斜側和朝向的上表麵在60度的入射角進入棱鏡中心在全內反射的底部。 當聚焦透鏡插入光路,光束遵循相同的過程,但更薄、更強烈的。

標本室,這可能是一個塑料培養皿或培養皿,置於顯微鏡下觀察期。 一小滴浸介質(甘油或油)放置在棱鏡上,並由聚光器齒條機構提高帶來的文化室的下表麵的光學接觸。 然後是激光束的聚焦透鏡位置譯者調整內部全反射在燃燒室的上表麵(或基片)和遵循一個對稱的過程返回在棱鏡對麵鏡座。 此設置適用於許多類型的基板,但特別適合觀察細胞在塑料培養皿底部生長。 然後,細胞可以被視為在該室最初被播種後沒有重新安裝步驟。 在一個直立顯微鏡觀察試樣使研究者同時探測細胞微量移液器,片夾,和注射器,提供物鏡有足夠的工作距離。

二次熒光發射可以通過幹燥,收油,或水浸物鏡(調遷後的大部分緩衝)通過蓋玻片,懸浮的細胞單層表麵上方間隔。 另外,一個傾斜的錐水浸物鏡可以直接放置到緩衝溶液浸泡的細胞。 直立顯微鏡結構是非常方便的,因為樣品可以互換,因為他們很容易與標準照明係統。 的TIRF照明區域的位置也通過固定和不受影響的,即使在移動台顯微鏡,占絕大多數的現代正立顯微鏡設計。 主要的缺點是沒有切換到另一個棱鏡具有不同的傾斜角度的入射光角度不可調。

一個直立的係統提供了高質量的圖像水浸時的物鏡是潛到直接通過發現培養皿或培養室的緩衝溶液中圖像的細胞,但結構是否存在幾個缺點。 許多用於培養容器結構的聚合物製劑有一定程度的熒光,這可能會降低弱熒光樣品的對比。 這種效應可以複合如果浸耦合介質不慎重選擇。 浸泡油的幾個商業品牌也顯示熒光在不同層次,調查員警告檢查浸入油和塑料培養器皿潛在的熒光效應在使用它們之前的TIRFM實驗。 不同品牌的組織培養塑料在顯示在激發自體熒光的量有顯著的變化。

棱鏡,滑動窗口和蓋玻片,室,可以在大多數應用普通火石光學玻璃製成的,除非短穿透深度從高折射率產生所需的。 光學玻璃不透光的低於約310納米,也有一個較長的衰減時間,昏暗的光反射,可以在一些漂白實驗問題。 高質量的自發光的熔融二氧化矽(石英)要低得多。 更奇特的高折射率的材料,如藍寶石,二氧化鈦,鈦酸鍶,不會受到高水平的熒光產量漸逝場的穿透深度超過比光波長低一個數量級。

熒光檢測

不同的共聚焦和多光子顯微鏡,許多TIRFM圖像可以被記錄在電影中的方式類似的顯微鏡,在很大程度上依賴攝影經典形式(明場,暗場,微分幹涉相襯,,等)。 在某些情況下,尤其是當隻有幾個熒光標本中存在的,最好是使用更敏感的成像設備,如強度增強的冷卻CCD攝像機,科學,雪崩光電二極管,或光電倍增管。 時間推移cinemicrography也有可能在TIRFM實驗,和圖像幀序列可以與任何上述設備拍攝,其中選擇將取決於二次熒光強度和暴露時間獲取圖像。 豐富的熒光樣品可以記錄在膠片上(或單獨一幀序列),但圖像采集與視頻或CCD攝像機是目前硬件現成的調查人員更方便。

通用性大量時提供的圖像獲取與光電倍增管或雪崩光電二極管。 光電倍增管通常采用空間懸而未決但快速檢測和熒光強度的定量分析。 可變孔和/或圖像平麵膜片(以上)使研究者可以選擇性地捕獲的完全可用字段的部分。 這是有用的當長的采樣間隔在低光照水平是必要的,或隻有部分的視場的興趣。 光電倍增管的光譜特性,應當選擇一個圖像采集裝置的考慮,這些應該被檢查的熒光團的發射特性一致。

結論

在一般情況下,全內反射更難在顯微鏡由於激光束的焦點調整需要調整到顯微鏡的焦平麵與光軸移動階段已經實現。 當選擇一個顯微鏡技術研究,注重機械穩定性和樂器的結構基序。 倒置或直立顯微鏡在隔離表一個沉重的框架將使研究者建立脆弱的漸逝場的相對振動自由的環境。 聚焦激光照射源保持在幾微米的範圍內長時間是困難的(最好的),但可以通過當顯微鏡,激光光源,並支持光學元件固定在適當的安裝和牢固地固定在工作台或顯微鏡階段。

廣泛的顯微鏡物鏡的設計與實驗兼容技術。 唯一的絕對的要求是,物鏡有足夠長的工作距離觀察接口在緩衝溶液的墊片厚度薄差距的定義。 聚四氟乙烯和氯丁橡膠墊片可以比任何標準的物鏡工作距離較薄,同時仍然比漸逝場的穿透深度大得多。 這減少了無法專注於接口的可能性,但並不能彌補潛在的畸變,在樣品/緩衝區的折射率變化引起的。 在大多數高放大倍率的物鏡的球麵像差校正的關鍵取決於試樣被立即在蓋玻片的遠側,而不是在一個額外的薄水層。 結果可以是一個圖像對比度不足,產生朦朧的形象甚至當銳聚焦。物鏡 規範沒有一般的規則可以提供,但水浸的物鏡(或浸漬或那些需要蓋玻片)可能是最好的(也是最貴)的選擇。 另一方麵,TIRFM實驗已經成功地進行了與幾乎所有市售的數值孔徑和放大的物鏡。

在許多研究,它是理想的快速開關的照明之間的界麵的全內反射和更深入地滲透到試樣的體積由經典的落射熒光照明。 作為一個例子,一個短暫的過程中可能涉及的同時,但有些不同,在膜和細胞質的變化,兩者都必須被記錄。 專門設計的光電係統,利用聲光調製器由若幹研究已經描述了。 這些結構是由電腦控製的,通常包含多個調製器的行為同步振蕩TIRF和落射熒光寬視野之間的亮度,同時采集數據與光電倍增管和快速響應的光電二極管裝置。

玻璃表麵支持細胞的粘附性往往是塗有特定的基板技術研究。 的二氧化矽的表麵化學衍生物可以產生獨特的物理和化學吸收特性,在調節模型膜和類似結構的形成是有用的。 此外,某些特定的化學共價結合在細胞生物學和生物物理學是特別有用的。 細胞粘附可通過附件的多聚賴氨酸對玻璃表麵增強,和疏水性的表麵可以長鏈碳氫化合物的脂質單層吸收了。 其他有用的分子,可用於治療表麵選擇性特異性包括抗體,抗原,平麵的磷脂,和外源凝集素。

層鋁薄(20納米的區域),它可以淬滅熒光,也可以應用於標準的真空蒸發玻璃表麵。 沉積厚度可以通過完全蒸發前測鋁量的精確控製。 沉積後,鋁膜的上表麵自然氧化物在大氣中產生一層薄薄的鋁氧化物。 氧化物塗層膜具有相似的二氧化矽的化學性質,可以衍生的在一個類似於玻璃的方法。 一種金屬膜幾乎完全淬火的熒光團的熒光在約10納米的能力允許從標記的蛋白質的非特異性吸附到襯底的信號抑製。 這發生在允許從更遙遠的標記的蛋白質吸附到附著膜熒光。

不同的共聚焦顯微鏡的光學部分,產生排斥的焦點發出的光與一組的圖像平麵針孔光闌,TIRFM是有限的地區在幾百納米的玻璃/緩衝界麵的全內反射的發生。 激光共聚焦顯微鏡具有通用性明顯的優勢,因為光學切片的作品在任何平麵的試樣並不僅限於不同的折射率之間的接口。 然而,TIRFM確實有幾個優點包括一個非常薄的光學部分(約100納米和600納米的共焦),相鄰的界麵附近區域選擇性的照明,並有能力(相對便宜的)適應現有的顯微鏡利用技術。



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