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奧林巴斯顯微鏡共聚焦顯微鏡的物鏡結構

2014-09-30  發布者:admin 

  任何常規光學顯微鏡的配置,物鏡是在確定圖像的信息內容的係統中最關鍵的部分。 精細標本細節的對比度和分辨率,其中的信息可以被獲得的樣品內的深度,和圖像領域的橫向範圍都是由物鏡的、用於觀測的具體條件下的性能確定的設計。 額外的要求是在共聚焦掃描技術對物鏡,在這個關鍵的成像組件也可作為照明聚光鏡和經常需要進行高精度在很寬的波長範圍內和在非常低光水平,不引入不可接受的圖像退化的噪聲。

無論任何其他係統組件的功能,沒有信息可以被添加到圖像,不是最初的物鏡捕獲。 在成像路徑一定的中間組件可以執行校正功能,但它們的主要性能要求是降低物鏡受到盡可能少的基本圖像信息。 傳統上,一個特定的應用程序在物鏡選擇考慮的首要因素已經被放大,無論是幹燥或浸泡的設計要求,與透鏡係統的數值孔徑。 新的成像技術,通過技術改進激光器驅動,熒光染料的發展,新的樣品標簽的能力,以及不斷改進的光學顯微鏡的生產廠家,具有顯著增強在某些研究領域的進展。 這是在細胞和分子生物學和神經科學領域尤其如此,和激光共聚焦顯微鏡結合熒光技術已被廣泛地依賴作為一種研究工具。

圖1給出了一個高性能的物鏡專門設計用於在光譜的可見光和紅外區的激光照明。物鏡 是60X平場複消色差透鏡水浸泡(平場)模型,這是波長範圍從450至1100納米的修正。 這一物鏡的有用的應用程序之間的同步熒光法和微分幹涉對比( DIC )無色差的可見熒光和紅外DIC圖像之間的觀察。物鏡 上也裝有一個校正環,使玻璃蓋的厚度和球麵像差的成像時,深部組織內或通過水溶液還原波動調整。 球形和色差在400-700納米區域的像差校正,也可用類似的物鏡,如模型設計的紫外成像下降到350納米的。 後者的物鏡的幾個版本(見圖2)進行校正,使紫外光的激發下,藍色發射到同一個焦點為可見光,從而實現真正的共聚焦成像的整個視場。

放置在物鏡在共聚焦儀器的總體要求是類似於那些在其他關鍵顯微鏡的應用,盡管不斷增長的需求的新技術所帶來的更常見的比以往的方法這些透鏡係統的性能極限。 某些應用程序的特定的局限性表明了其他物鏡的特性可能是一樣重要,甚至更重要,比那些傳統上被認為是最重要的。 為了滿足目前有前途的技術的基本要求,製造商已經推出了專門針對這些方法的優化性能的新型光學。 高數值孔徑的發展,高度校正浸水物鏡是響應於在活細胞和組織的研究急劇增加的一個例子,它是通過在含水介質中進行的必要性。 這是可能的,在激光共聚焦顯微鏡的具體要求,將導致光學的發展,不嚴格正確的一個或一個以上的分辨率影響畸變實現其他的設計物鏡,聚焦性能是更重要的青睞。 通常討論的例子是在活細胞研究的較高的光子收集效率的需要,這可能為物鏡,犧牲一定的像差校正以最大限度地提高透光率發展的激勵,尤其是在關鍵的熒光發射波長。

光學係統的分辨率是普遍接受的是兩種試樣的功能,使他們能夠區分為最終的圖像分離之間的最小距離。 在一個指定的對比度,視覺識別所需的基礎定義,分辨率可以量化為一個光波長的函數( λ )和數值孔徑(na )的光學係統。 之間的衍射波前幹涉圖像平麵產生的艾裏斑的光強分布,其直徑( D )是由下麵的公式,在理想的衍射受限係統:

dAiry = 1.22 • λ/NA

著名的瑞利準則考慮兩個相同點難以辨別時,由艾裏斑直徑的一半分離。 因此,通風的半徑( R )是等效的橫向分辨率,並通過修改前麵的方程定義。 當熒光被利用,物鏡函數作為聚光鏡和物鏡,因此在下麵的表達, na 代表物鏡的數值孔徑:

rAiry = 1.22 • λ/(2 • NA)

衍射的限製,導致強度的橫向再分配從對象到通風模式也產生散焦沿著光軸,從而改變圖像的點的大小和形狀。 三維強度的點擴散函數描述的強度分布和代表轉移標本信息的圖像平麵的光學係統的性能。 一係列的光學像差的透鏡係統的特征,以及任何不受物鏡設計或補償由另一個光學元件校正將改變代表圖像中的每個樣本點的強度分布,降低相對於理想衍射性能有限的圖像。 在激光共聚焦顯微鏡應用的潛在異常的相對重要性必須在物鏡選擇的技術考慮。 在物鏡設計和性能的主要因素,因為它們涉及具體的共聚焦顯微鏡,在下麵的章節中討論。

目前,應用最廣泛的生物應用共聚焦顯微鏡配置采用了計算機控製的掃描係統,使照明激光束聚焦,通過物鏡的,在一個固定的標本。 這是被稱為 離軸 激光共聚焦掃描因為掃描光束偏轉的光軸的每一側並利用物鏡元件周圍地區。 早期實現在光學顯微鏡掃描技術的應用 掃描的激光束保持固定在光軸與試樣階段或物鏡進行掃描。

雖然在原則上兩種掃描方法可以產生相似的結果,以選擇最佳的性能物鏡的要求是明顯不同,在軸和離軸照明掃描,並考慮發射熒光收集的物鏡也不同。 三分之一掃描式利用紡絲 尼普科夫 磁盤掃描大量的照明點在試樣不移動光源或顯微鏡階段。 雖然這種方法被廣泛應用在半導體行業,可以允許實時反射光聚焦的觀看,這是不常見的應用於生物儀器。 尼普科夫係統可能在活細胞的調查,然而變得越來越重要,因為他們的潛力,以減少細胞損傷與配置采用高強度的激光源。

透鏡像差影響的物鏡表現可以分為兩類,包括那些非色(不變的波長),和色差,這是依賴於波長。 色差是任何 橫向色差 縱向色差 ,和波長獨立組包括 球形的 畸變, 昏迷 散光 場曲率 ,和 失真 色差和球麵像差的影響整個圖像領域,而在離軸區的殘餘像差更普遍。 色差和球麵像差(見圖3)是最有可能的聚焦性能的影響。 一般來說,色差不能被修改的程序,必須通過光學元件的設計處理。 其他文物,尤其是球差,通常是加劇了物鏡的或不匹配的光學元件引入的不當使用,但可以減少或補償後的適當的技術或與該光學係統的調整。

球麵像差

球差是非的色差,是最重要的聚焦性能,是球麵透鏡組件,使軸和周圍光線被集中在連續的平麵性的一種表現。 不同程度的折射光線路徑通過不同的鏡頭帶結果中的一個點源的聚焦圖像模糊,並產生一個不對稱的強度變化的上方和下方焦平麵。 在所有的現代物鏡,校正球麵像差視覺上察覺不到的水平,如果指定的操作變量為物鏡的設計完全滿足。 不幸的是,存在幾種可能性,在實踐中允許從物鏡的光學設計的標準偏差,並引起球麵像差。 由於球麵像差隻能精確規定的距離關係的物鏡和標本和圖像平麵之間的適當修正,工件可以不經意地介紹,如果物鏡指定的管長度不能維持。 這如果是用在有其他比所需的管的長度在一個有限的校正係統顯微鏡發生,或由光學元件引入,如過濾器,為會聚光束路徑在這樣一個係統。

球麵像差的最佳修正需要認真注意的成像介質的物鏡外,這是另一個潛在的性能退化的來源。物鏡 特性是由設計和不定會適應的操作條件範圍內(以校正鋌提供調整除外)。 這可以增加顯著的球麵像差的因素是質量差的浸油的物鏡和標本之間,非標準的蓋玻璃的厚度,樣品安裝介質,和試樣本身。 任何物質進入和樣品之間的物鏡鏡頭前表麵的成像係統的一個重要組成部分。 在高數值孔徑的堅持的物鏡設計的要求變得更加重要。 玻璃蓋的厚度和折射率可以提高球麵像差的變化,特別是“幹”(非浸泡)物鏡。 高數值孔徑的幹燥的物鏡一般是專為一個0.17-mm玻璃蓋的厚度的最佳性能,具有標本直接安裝在與玻璃接觸。

允許的球麵像差的校正時,非標準蓋玻片厚度時,很多物鏡都配備了可調校正環,可以設置一係列的厚度設置。 校正環通過翻譯內部透鏡組來改變物鏡焦距。 即使一個正確的厚度蓋是用玻璃,一層玻璃和試樣之間的介質安裝存在偏離理想的光的情況下,將增加的球麵像差的程度。 校正環也可以被用來減少由這種性質的折射率變化引起的球麵像差,在激光共聚焦顯微鏡會降低強度在針孔和深度減少歧視由於軸向焦點轉移。

油浸式物鏡通常是優化使用一個0.17-mm厚度在指定波長的折射率1.518的玻璃罩,和浸油的精確定義的折射率。 通過對玻璃蓋和沉浸介質指定的操作條件下,球麵像差可以通過波長為幾個值的物鏡設計校正(取決於物鏡的類型)。 之間的匹配的每種材料的折射率在光路中的重要性,從試件和安裝中物鏡鏡頭前的元素,在曆史上一個最棘手的成像條件,特別是在試圖達到高分辨率的生物標本。 亞細胞成分的折射率是大大低於常規浸漬介質,在許多情況下,這些折射率是不確定的,改變整個試樣。 即使在固定材料,安裝介質折射率通常是不相同,可用浸泡油。

活細胞中的動態過程的研究,這是培養並維持生理鹽水,油和水的折射指數的結果對油浸物鏡性能的一個關鍵限製的不匹配。 主要的問題是,高數值孔徑的油浸物鏡的潛力是不是由於水的折射率之間的不匹配的實現(1.33),浸泡油(約1.5)。 在共聚焦顯微鏡的應用的一個關鍵因素是提高熒光成像和厚的樣品的三維表示,和球麵像差時引入的油浸物鏡是限製水標本深度為中,可接受的圖像可以得到。 在一般情況下,高數值孔徑的油浸物鏡是設計用來在圖像平麵的不超過15至20微米的玻璃蓋下。 當應用於水的標本,然而,球差引起的在水玻璃蓋接口可以達到相當的水平在深度為10微米。 作為一個例子,點擴散函數,如圖4所示出增加的程度球差發生平場複消色差透鏡油浸物鏡在穿透深度範圍從零到8微米。

在從水生物標本采集三維數據,利用激光共聚焦熒光顯微鏡技術的興趣被廠家引進一批高數值孔徑的主要誘因,高度校正浸水物鏡。 球麵像差是活細胞的共聚焦研究的一個主要的光學限製時的油浸物鏡的影響,和成比例增加的深度觀察到水性介質和可變的子細胞成分(見圖4)。 對成像的負麵影響包括對比度和信號強度,由於在發射的熒光強度到達探測器的針孔的分數減少損失,微小的標本特征分辨率損失,並減少 Z 軸的定位精度,從而影響的三維圖像重建的完整性。 利用水浸的物鏡成像時,試樣在水介質中顯著的深度下方的玻璃蓋,球麵像差的降解是可以避免或減少,使激光共聚焦技術的充分實現的好處。 能夠在水介質中超過200微米的深度收集準確的三維數據具有長工作距離浸水物鏡。

一個油浸物鏡,無論光學矯正的程度,是不能成像水浸泡標本的最佳選擇。 最佳的圖像質量可能是這個組合隻為在與蓋玻璃直接接觸標本地區。 在更大的深度,球麵像差,降低對比度和分辨率和減少圖像的亮度,在某種程度上,聚焦的信噪比大大降低的影響。 使用一個高度校正浸水的物鏡是降低引起的球麵像差成像時,在大的距離,在水介質中的最佳解決方案。 雖然設計的前透鏡元件直接浸入試樣中可用的物鏡,重點是采集三維數據所需的變化可能產生的序列中的圖像之間的試樣不良的運動。 為了避免這個標本運動時物鏡試樣的距離是變化的,一個玻璃蓋必須用在大多數情況下。

一些最近推出的高數值孔徑水物鏡將調整項圈提供球麵像差校正的變量,如在蓋玻片厚度波動引起的。 這種類型的校正環補償在生理介質和細胞成分的折射率的差異也是有用的,和折射率隨溫度和溶質濃度的變化。 由於這有助於引起的球麵像差的各種因素,可調節的校正是聚焦應用物鏡的一種理想的功能,即使在最佳厚度的玻璃蓋采用。

離軸像差

常見的光學像差簡稱 昏迷 主要影響的點源,遠離光軸,產生條紋狀的圖像點的徑向畸變,在視場角的嚴重程度增加(見圖5)。 昏迷是有點類似於球麵像差,可能是由同一因素引起的。 這是一般的像差校正在現代光學係統中的透鏡元件的適當利用,和物鏡中,昏迷和球麵像差被淘汰被分類為 消球差 因為昏迷是一個離軸像差,它具有共聚焦激光掃描係統的意義,它通常利用離軸光束的路徑,但不與樣品掃描一個因子(軸)的共聚焦顯微鏡。

幾何畸變的一些額外的類型可能對共焦物鏡性能的顯著,因為在區域的圖像場遠離中心的所有的都更加明顯,他們更可能影響到在激光掃描共聚焦係統的性能。 共聚焦成像的光學要求是,隻有高度校正光學係統有可能充分履行,和顯著的幾何像差通常會被最小化的物鏡從這類。 然而,它是有益的,要知道這些畸變和潛在的問題,他們可能會引入時,物鏡選擇,尤其是如果特定的性能特點是以犧牲另一個變量的優化可能在一個特定的應用程序是更重要的。

未校正 散光 可以減少圖像的清晰度和對比度,強度,增加的影響,從光軸的距離(圖5)。 像散的圖像點的幾何形狀可能考慮兩個正交的平麵,斷麵圖像的波前通過定義。 飛機(切向和矢狀麵)在像散係統可能有不同的焦距和表現出不同的半徑為完全對稱的樣本點。 這種畸變的結果在對稱的點,位於離軸是徑向或切向伸長的圖像特征,根據焦點。 當最好的重點是選擇在兩個極端之間的一種折衷的位置,由此產生的通風盤是非對稱的,導致圖像退化。 散光可導致低中心的元素在一個低質量的或損壞的物鏡,是顯微鏡的光路中增加了其他失調。

一個透鏡性質描述為 場曲率 野平坦度 是在許多關鍵的測量和高分辨率成像應用的重大意義,例如半導體檢驗,雖然在大多數生物共聚焦的調查,它不是一個嚴重的限製。 簡單球麵透鏡聚焦圖像點來自不同地區在一個平坦的試樣在彎曲圖像的表麵,這反映了透鏡表麵的形狀。 平麵圖像平麵不符合焦點曲麵,其結果是該領域的中樞和外周區不能同時把焦點對準。 更複雜的透鏡組成的透鏡元件的設計,多個團體,是必要的正確的這場曲率和擴大的焦點中心區的大小。物鏡 指定為 平場 平場 糾正光學產生從中心到邊緣具有清晰度廣泛的適用領域,以最小的場曲,在中間圖像平麵。 在最後的圖像平麵場的平整度也依賴於中間的光學元件,包括顯微鏡目鏡。

現代的物鏡是能夠產生清晰圖像領域是大約兩倍,在早期的物鏡的可用字段直徑。 專門的抗反射塗層,使這一成就的技術創新中,雖然增加了光的複雜性降低的光傳輸和更大的成本。 在激光共聚焦生物應用厚截麵或活細胞成像,非平場物鏡的使用可能會容忍由於物鏡產生的截麵曲率相對微不足道的其他因素的不確定性對精確的試件形狀。 如果其他光學畸變校正,在三維數據集的任何潛在的失真可以糾正輕微場曲率引起的。 在許多情況下,奈奎斯特采樣條件可能隻需要物鏡字段的中央部分,利用。

從中心到邊緣的圖像場放大產生的幾何非線性 失真 試件的特點,使他們真正的三維輪廓被扭曲的圖像。 如果存在的話,這種作用是很容易觀察到,當交叉線正交組的成像,而不是出現在整個圖象場直,線可以是向外或向內彎曲的區域遠離磁場中心。 這兩種類型的失真通常被稱為 枕形失真 失真,分別。 是場曲率的情況下,少量的幾何失真通常在生物學中的應用並不是很重要的,但可在材料科學研究至關重要如果缺陷分析和精確測量的物鏡是。

色差

畸變是由兩個基本的光學現象,具有波長依賴性引起,產生不同類型的圖像缺陷。 一種類型的色差的事實是,所有的光學玻璃的折射率隨波長而引起的,而在放大率隨波長變化的第二個結果。 折射率與波長的依賴關係(通常稱為 色散 )產生不同波長的光的有效焦距差。 因此,對於一個由一個單一的玻璃組成的簡單的鏡頭,隻有一個波長(或一個窄的波長範圍內)可以精確地聚焦在一個特別關注的背景圖像平麵。 其它波長的光將集中或接近或遠離鏡頭。 由此產生的光譜色散沿著光軸被稱為 縱向色差 ,或者, 軸向色差 (見圖6)。 為一個點源成像的光學軸,折射率的漸變引起藍色的光被聚焦的最近的鏡頭,波長較長的會聚在重點逐步遠離透鏡。 的像差,如不加以糾正,可以看成是不同顏色的條紋圖像時失焦的最好的視覺焦點的兩側。

未校正的縱向色差在用於激光共聚焦顯微鏡物鏡可以產生深遠的影響,尤其是當成像兩種或兩種以上的熒光團,這取決於能力證明在幾個波長的熒光共定位。 當多個熒光團,縱向色差引起的各種激光激發光束可以聚焦在樣品中的不同點,和類似的結果在不同的發射波長收集非重合點。 這種畸變對建立的熒光團的準確位置的可能性 Z -在三個維度的樣本數據生成的方向。

在激光掃描共聚焦技術,為一個特定的物鏡色差圖像的完整性的影響的評估需要的所有因素,確定穿過針孔,記錄由檢測器的信號能量的考慮。 這些因素包括激發激光發射譜,每個熒光團的發射峰和帶寬,和探測器的光譜靈敏度。 縱向色差校正通常是由具有不同的光學特性的多個透鏡元素的組合的物鏡設計完成,修正為物鏡,為不同的類別分類的基礎部分和程度(見下文)。

透鏡的焦距與波長的變化,從而產生表征縱向色差軸向擴散,同時還負責發生 橫向色差 (見圖6)。 由於放大率是成反比的焦距,焦距與波長的變化,產生相應的放大對波長的依賴。 如果這是不物鏡像差校正,圖像中的鋒利的邊緣,可能被包圍的紅色或藍色的條紋。 從藍色波長成分信號放大率可能會有所不同從約1的紅色分量百分之2未校正的物鏡。 當在一個共焦掃描光學係統,橫向色差可以導致在針孔信號丟失,因為可能發出的光將拍攝地點是接近或遠離光軸比真正的試樣的位置,這取決於光的光譜成分。

因為這兩種類型的色差是相關的,物鏡是高度校正縱向色差一般表現出最小的橫向色差和。 采用不同的方法通過顯微鏡廠家中的光學性能的影響的各種因素的校正,和係統組件的仔細匹配是獲得最大校正像差本質。 共焦熒光顯微鏡,未校正的橫向色差的結果在誤差進行了映射的熒光發射不同波長的位置的縱向變化類似的問題。

大部分的光學顯微鏡製造曆史,為物鏡的設計標準後,所需的物鏡在一個指定的固定距離的物鏡安裝表麵形成一個真正的圖像,對應於目鏡前焦點平麵。 基於物鏡的真實的中間圖像直接形成的結構稱為 有限 係統,和距離的中間圖像被稱為 管長度 的物鏡。 雖然在同一時間,各廠商的標準有限光學係統在同一管的長度和齊焦距離,不同的方法被用來補償透鏡的像差,而這個因素必須如果來自不同製造商的光學元件組合使用,考慮。 有限的係統可被設計為在物鏡提供充分的像差校正,或一個已知的殘留水平橫向色差可以在物鏡上形成的圖像,這是由目鏡補償。

無限的 光學係統,光線離開物鏡不集中,但保持平行,直到被會聚在中間圖像平麵的 管材 透鏡(有時稱為 特蘭 鏡頭)。 最主要的顯微鏡製造商已經開發出無限遠校正光學係統,這從物鏡的光線的內在利益,聚焦於無限遠處,是相對不敏感的附加的光學元件放置在“無限空間”之間的物鏡和管透鏡。 雖然管透鏡可以執行一些殘餘像差校正,在設計,提供完整的校正內的物鏡性的優勢,與管透鏡光學中性。 圖7給出了典型的直立和倒置熒光顯微鏡無限光通路。 雙頭白色箭頭在每個顯微鏡圖顯示物鏡後孔和管透鏡之間的平行光路。

不同廠家的堅持在無限係統不同的設計規範,包括管透鏡的焦距長度和無限的空間。 無限遠校正光學係統的物鏡是使移動以代替顯微鏡的階段,在觀察期間,要求試樣的微妙的操縱應用的一個明顯的優勢。 然而,在無限空間的主要實踐的好處是,輔助光學元件,如偏振光分析器,過濾器,和微分幹涉對比 DIC )棱鏡,可以添加未經其折射性質或厚度主要關心的。 隻要他們有平麵平行的表麵,添加元素對圖像質量的影響可以忽略不計的有。 相反,光學組件不能置於有限校正係統的光路,這是收斂的物鏡和中間圖像平麵之間,而不引入圖像移位和其他像差的厚度和折射率不同的添加元素。

在顯微鏡的物鏡的光學校正

不論一個有限或無限遠校正光學係統的應用,設計了係統的物鏡相結合的性能標準,必須考慮到在確定的物鏡,將滿足特定成像技術要求。物鏡 通常分為根據其光學矯正度性能類別。 作為討論的相對重要性,各種像差和性能指標的影響取決於他們的方式是用物鏡和應用的基本要求。物鏡 的最一般的分組通常是基於他們的像差校正的程度,雖然傳統的物鏡類別已變得不那麽明顯的最近,由於在光學設計和製造技術的重大進展。 大部分的描述性術語仍然是有效的和廣泛使用的,和所使用的術語的理解和他們如何涉及到聚焦的應用是非常重要的當各種可用的物鏡正在評估。

色差是用於製造透鏡的光學玻璃由於分散,通常利用相結合的具有不同色散特性的透鏡元件校正。 傳統上,具有最小的校正色差的物鏡分為 消色差透鏡 (見圖8),通常采用玻璃具有正常色散。 這種類型的眼鏡具有折射率隨波長的近線性下降,包括冠和火石玻璃。 冕玻璃通常具有低的折射率、低色散,在對比火石玻璃,通常具有高折射率和高色散。 中老年消色差物鏡,兩個或兩個以上的這些類型的玻璃透鏡元件相結合,提供色差校正帶來了紅色和藍色的光聚焦到一點,也為綠色光的球麵像差校正。 現代的消色差物鏡的球麵像差通常有額外的校正,和場曲的重要修正。 如果物鏡是糾正延長平整場整個圖像域,它是指定平場 消色差透鏡 在一般情況下,消色差物鏡傳統的明場觀察是合適的,和顯微攝影和數碼影像與額外的( 平場 )場曲率校正。

為了實現改進的色差校正,玻璃類型具有反常色散的光譜的一部分是必需的。 在顯示的折射率與紅色和藍色光譜區域波長的非線性變化的眼鏡,色差可以抵消允許多個波長的同時重點。 結晶螢石是第一個發現的材料來減少未校正二級光譜負責綠色或紫色條紋,邊緣鋒利的邊緣提供合適的光學性能的表征,獲得消色差圖像。 在各種光學玻璃的組合,螢石元素提供的能力,正確的色像差的三波長(顏色)和兩個球麵像差。 此外,這種高度修正物鏡改進傳輸特性在紫外線光譜區。

更近來的技術發展已經提供了新的光學玻璃配方和透鏡成形產生類似螢石元件的色散特性,而大多數製造商生產線的具有光學校正接近那些最高類別(圖8) Fluor 的物鏡的能力。這些物鏡有時稱為 半複消色差,並且可以或可以不含有螢石的元素,但由於它們的光學特性的,但卻指定由不同的製造商,其名稱為 FlPlanFlFluorPlan FluorNeofluor,和 Plan Neofluor 。這一類的當前物鏡是在許多配置中,包括用於與多個浸沒介質的使用模式可用,並且適合於在明場,熒光,相襯,偏光,和微分幹涉對比使用,以及一些共聚焦和多光子應用。

物鏡分類 複消色差透鏡 通常都是那些對色差和球麵像差校正的最高水平(見圖8)。 這些物鏡通常有最高的有效數值孔徑,對於一個給定的放大,和色差和球麵像差至少三波長校正。 隨著畸變幾乎完整的校正,複消色差的物鏡一般是適用於任何顯微鏡技術,雖然所有的技術采用特定的性能要求,必須考慮。 在光學矯正所表現出的消色差透鏡異常程度的怨恨,因為他們利用反常色散透鏡元件(通常包括螢石),他們可能不適合某些偏光顯微鏡的應用程序或紫外熒光激發的最佳選擇。 因為天然螢石晶體,它可以限製偏光性能降低的最大消光係數可以實現的,並且可能包含有機汙染物與不良的熒光性質。 除非一個複消色差物鏡是專為偏振光,在近紫外光譜區域,克服的局限性,在螢石物鏡(半複消色差透鏡)可能提供更好的性能,在某些應用。

共聚焦熒光應用受到嚴重限製如果物鏡像差校正不同樣的激發和發射波長,更難以滿足要求時,使用或多個熒光團的激發和發射波長之間的差異是大的。 為了實現最大的檢測到的光子能量,照明光斑和檢測區域的成像在針孔之間必須保持齊焦。 許多物鏡,即使在複消色差透鏡類,不提供紫外激發熒光技術結合適當的校正可見光發射。 附加的光學元件可以采用在紫外激光源補償的物鏡無法容納在寬波長範圍,雖然這增加了費用和大量的運算複雜度的共焦係統。

高性能水浸的物鏡已經最近推出的最主要的製造商,和許多這些物鏡是專門設計來滿足當前快速發展的研究領域提出的要求。 一個主要物鏡是在生物標本共聚焦熒光顯微鏡實現最佳的性能,包括活細胞和組織的生理媒體支持。 這是認識到,無論像差校正納入一個物鏡的設計水平是必要的,額外的像差可以通過違反設計的操作要求引入外部物鏡的光路,這會降低性能的最佳成分。

新的水浸的物鏡(見圖9)避免這一類型中最常見的問題,這是折射率之間的不匹配和試樣浸泡媒體。 他們還提供高分辨率和大數值孔徑的設計改進的光收集,並有較長的工作距離。 此外,特別注意的是給定的紫外線波長的高傳輸,並擴大光學校正從紫外到可見光發射區常見的熒光團,以維持激勵和信號采集共焦條件。 奧林巴斯,例如,提供一係列的專業 W LSM 浸水高數值孔徑複消色差(激光共聚焦顯微鏡;參見圖2),這是一個大的平場校正,和從約340至650納米的延長複消色差校正。

專為直接浸泡或水浸的物鏡,具有專業的陶瓷或聚合物nosecones,可用於活細胞和生理的研究(圖2)。 這些研究往往需要測量或其他操作的標本,不能做有一個玻璃蓋。 一般水浸的物鏡是在螢石的範疇,在紫外線和紅外光譜區具有較高的傳輸,並設計了長工作距離的規格和插入窄的輪廓(浸漬)在物鏡的鼻子部分。 小角鼻上的物鏡是為了讓附件微電極最大訪問標本或執行其他操作期間觀察。 長工作距離,這可能與這種風格的一些物鏡幾毫米,也提供更大的訪問的標本。 許多浸物鏡浸泡部分是由陶瓷或其它惰性絕緣材料的電氣隔離和耐化學性。 他們的特征的組合使得水浸物鏡適合活標本共聚焦,多光子電離,和許多其他的成像方法。

除放大,數值孔徑,和程度的光學校正的,物鏡的 工作距離 在用於獲取三維標本信息共聚焦顯微鏡和其他數字顯微鏡技術的特殊意義。 工作距離,物鏡要求的玻璃罩,被定義為玻璃蓋和前透鏡元件的頂麵之間的距離在蓋玻璃接觸試樣麵關注的焦點(圖10(b))。 這個距離是重要的時候,共焦成像是在不同深度的標本,因為它決定了最大侵徹深度,是可以實現的重點在物鏡接觸玻璃蓋的頂部。 工作距離,因此,限製的範圍內沿 Z 軸從樣本數據可以收集。

作為一個例子,與0.20-mm物鏡(200微米)的工作距離可以被聚焦到一個200微米以下的玻璃蓋的最大深度在物鏡上的蓋玻璃表麵接觸。 在一定範圍內,工作距離可由光學設計不同,雖然它通常降低放大,數值孔徑的增加,和光學校正。 保持大數值孔徑和高度的長工作距離的像差校正是通過簡單的幾何約束條件,通過鏡頭的元素和在一個高度校正的物鏡所需要的數量施加限製的形狀。 許多現有的物鏡規格代表成績顯著的性能改進的光學眼鏡,鏡片塗層的有效實現,和計算機設計的能力。

事實上,信號強度是放大的平方成反比,在共聚焦顯微鏡在優化物鏡選擇的影響,在某些情況下,改變各種性能因素的相對重要性。 一些研究人員認為,厚的組織切片成像的亞細胞成分,它通常是有利的選擇溫和放大的高數值孔徑的物鏡以浸泡半複消色差物鏡類別獲得最大的光收集。 當利用共聚焦掃描係統與電子變焦功能,它采用100倍光學放大很少是必要的,和高度校正(和高數值孔徑)40x和60x物鏡可能受益於額外的光收集技術更適合。

許多流行的技術,如熒光成像,從根本上受到這樣的低光水平,該光學係統的傳輸特性是至關重要的。 隻有少數的光子可用於微小細節的標本檢測,並因此在熒光激發和發射波長的傳輸率的一個相對較小的差異可以在確定一個標記的特征可探測的關鍵。 在某些情況下,物鏡的傳輸性能可能比其他規格如野平坦度和像差校正的意義更大,這需要額外的鏡頭和塗料,可以增加一個關鍵的波長頻帶的光損耗。 複消色差校正可能危及其他物鏡的要求,正如前麵所討論的關於偏振光的性能,並降低光傳輸中的紫外或近紫外範圍一直被一個全像差校正的成本。

在較寬的波長範圍內提高傳輸性能物鏡的同時還實現了高水平的像差校正已在共聚焦熒光應用尤為重要,許多最近的高性能物鏡,包括水浸泡,已在紫外高傳輸優化。 它是在技術使用波長考慮物鏡的傳輸性能的重要,這樣的數據通常可從物鏡的製造商。 特定的光譜傳輸特性的光學玻璃組成的確定,采用的水泥複合透鏡元件之間,和塗層的透鏡表麵。 作為透鏡設計的複雜性增加,塗層的透鏡的重要性減少內部反射已變得越來越重要。 早期簡單的單層塗層大大提高了整體的傳輸,並不斷細化的專有材料的多層塗層進一步使透鏡設計師拓展所需波段物鏡傳輸,即使鏡片數量和物鏡的整體的複雜性顯著增加。

專業的技術被應用於細胞和分子生物學的問題迅速發展的領域,以及在其他領域,導致了在要求對光學成像係統的變化,特別是考慮到顯微鏡物鏡。 生物標本的三維調查在共焦掃描技術利用的急劇增加是影響產品的商業開發的一個主要因素,雖然方法如激光捕獲,多光子激發熒光共振能量轉移 FRET ),熒光 原位 雜交FISH ),和紅外微分幹涉對比也提出了新的要求。 一些專門的技術參數表明了某些傳統的物鏡的績效標準可以是至少部分地犧牲為了提高其他更重要的規格。 在計算機輔助透鏡設計和光學玻璃配方的巨大進步,除了那些在抗反射塗層技術,使得能夠滿足許多新的要求,改進的光學導論,很少或沒有權衡在傳統的寬視場顯微鏡。 這些具有更高的數值孔徑高性能水浸泡的物鏡,增加工作距離,球麵像差校正衣領,和增強的紫外線和紅外線傳輸物鏡。

許多現代的物鏡是適合使用在激光共聚焦顯微鏡時,利用其設計規範的一致性。 對於許多應用程序,以小於全複消色差校正的物鏡,如螢石類半複消色差透鏡,是作為一個通用的物鏡,可以在多聚焦技術的一個理想的妥協。 高分辨率的檢測及與激光掃描共聚焦顯微鏡厚水標本的精確三維成像是特別的要求和需要滿足以下所有標準的物鏡:高效熒光收集高數值孔徑,長工作距離允許的最大穿透深度,精確的三維重建的平場,低軸向色差的多個熒光團的齊焦,和較低的橫向色差,使多個熒光圖像的精確配準,除了高傳輸在激發和發射波長。



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