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奧林巴斯顯微鏡三重染色貼壁細胞

2014-10-03  發布者:admin 

  活力和物理的貼壁細胞在培養皿中培養生長特性可以用一個受歡迎的熒光染色,包括一個染色的探針組合很容易確定(線粒體)隨著鬼筆環肽(或phallacidin)與低分子量的熒光探針的合成。 在細胞的絲狀肌動蛋白細胞骨架的網絡可視化的有用的熒光標記中羅丹明,熒光,Alexa Fluor係列,與花青染料。 對染使用流行的各種染料核如下處理與線粒體和肌動蛋白探針。 此協議的細節的廣義程序染色各種細胞類型。

圖1給出了一個合並的共聚焦顯微鏡圖像堆棧(4光學部分)顯示細胞核,線粒體,和在一個正常的喜馬拉雅塔爾羊卵巢絲狀肌動蛋白網絡( OV HJ1。 線)的上皮細胞。 貼壁細胞培養,詳述如下在生長培養基中用MitoTracker Red CMXRos染(紅色),其次是鬼筆環肽共軛的Alexa Fluor 488,它的目標是聚合的肌動蛋白(綠色)。 細胞核染色用Hoechst 33342。 標本成像與100X油浸物鏡(沒有變焦)使用最大的針孔直徑設置在奧林巴斯顯微鏡FluoView fv1000在405納米的紫激光二極管組合(Hoechst),488納米的氬離子激光器(Alexa Fluor 488),和一個543納米氦氖激光(染色)。 圖像的灰度通道依次收集並隨後pseudocolored逼近的各探針的熒光發射光譜的顏色。 雖然這種熒光結合產生有用的圖像,其他探針在紅外吸收(如Mitotracker有深紅色的633和操縱核染料)可以采用相同的成功。

試劑

  • 粒線體介質 -染色的染料是含有50微克的再結晶提供探針瓶。 重建完成與二甲基亞碸( 二甲基亞碸 )使最終濃度為1毫摩爾的。 二甲基亞碸加入量取決於染料的分子量和如下。 添加DMSO後,渦溶液徹底讓混合物坐在黑暗中室溫5分鍾。 重複的渦流作用,然後離心樣品搬遷分散液滴到管底和稀適當的等分試樣。 所有染色的染料,稀3微升至10毫升(300納摩爾終濃度)的生長介質中進行工作的解決方案。
    • MitoTracker Red CMXRos 94微升DMSO每小瓶。

    • 粒線體橙CMTMRos 117微升DMSO每小瓶。

    • Mitotracker有綠色FM 74微升DMSO每小瓶。

    • 染色的紅580 69微升DMSO每小瓶。

    • 粒線體的深紅色633 92微升DMSO每小瓶。

  • 粒線體的洗滌介質 細胞是洗兩次完成介質染色的治療後,需要6毫升衝洗介質在攝氏37度每培養皿。
  • 固定劑 準備百分之3.7多聚甲醛溶解在完全生長的含血清培養基使用前。 每個培養皿中大約需要3毫升的培養基。
  • 通透性緩衝 百分之0.2的Triton X-100在PBSA(後立即使用30分鍾至一小時超聲洗滌緩衝)。
  • 洗滌緩衝液(通透後) -除了那些需要專門的緩衝區的所有步驟使用“核染料。
  • 封閉液 百分之1牛血清蛋白( 牛血清白蛋白 )在含有百分之0.05的Triton X-100 PBSA(增加2-3毫克疊氮化鈉每100毫升緩衝消除微生物的生長)。
  • 鬼筆環肽或phallacidin工作液 熒光鬼筆毒肽被提供作為凍幹固體含300單位產品。 內容必須溶解在1.5毫升的甲醇產量的最終濃度為每毫升200單位。 一個單位的定義是必要的染色一蓋玻片固定細胞的量,相當於5微升的甲醇溶液。 通過稀釋原液適量為封閉緩衝液製備的鬼筆環肽或phallacidin工作稀釋。 例如,50微升的溶液稀釋至1毫升與緩衝將使每使用100微升10蓋玻片蓋玻片染色。
  • 核染色 製備的核染色新鮮稀釋前染色。
  • 核染色洗滌緩衝液 -赫斯特和SYTOX染料需要漢克斯平衡鹽溶液( 漢克斯BSS ),而DAPI,以及單體和二聚體菁核染色,可用於計算。

核染液稀釋

  • 赫斯特(33342和33258) 稀釋在150毫升的漢克斯BSS 5微升10毫克/毫升原液(30分鍾治療)。
  • SYTOX綠色和橙色 稀10微升的濃縮原液(二甲基亞碸5毫摩爾)在250毫升的漢克斯BSS(30分鍾治療)。
  • DAPI 稀150毫升PBSA稀釋百分之50雙蒸餾水5微升10毫克/毫升原液(5分鍾治療)。

程序

注:染色處理對活細胞貼壁。 從生長的細胞去除介質和更換預熱(37攝氏度)含藥血清並在適當濃度的粒線體探針介質(約350-400納摩爾)。 培養細胞在二氧化碳培養箱45到60分鍾。

從培養皿的粒線體中吸出,加入3毫升的預熱(37攝氏度)每60毫米培養皿中。 將清洗介質在37度5分鍾允許未綁定的粒線體擴散到介質。 重複此過程,一旦固定前。

固定細胞貼壁快吸最後介質清洗和預加百分之3.7多聚甲醛熱(37度)的完全培養基,包括血清。 使細胞孵育15分鍾,在固定器在37攝氏度。

固定後,用洗滌液洗三PBSA變化的細胞(2至5分鍾洗)。 慢慢旋轉含有蓋玻片培養皿作為他們被洗滌在軌道搖床轉速每分鍾5-10。

溶解的貼壁細胞膜具有10至15分鍾的緩衝處理法。 慢慢旋轉含有蓋玻片培養皿所透在軌道搖床轉速每分鍾5-10。

通透後,隨著PBSA Triton洗滌液洗滌細胞三的變化(每5分鍾洗)。 慢慢旋轉含有蓋玻片培養皿作為他們被洗滌在軌道搖床轉速每分鍾5-10。

塊非特異性鬼筆環肽(或phallacidin)阻斷1小時的緩衝區的結合位點。 慢慢旋轉含有蓋玻片培養皿都被封鎖在軌道搖床轉速每分鍾5-10。

蓋玻片染色的支持

準備染色的鬼筆環肽支持覆蓋2×3英寸的顯微鏡載玻片和封口膜,如圖2所示。 確保封口膜使其緊密附著並沿玻璃表麵的均勻分布(無水泡)。 阻斷後,小心地取出蓋玻片從培養皿放細胞側下阻斷沉積在膜緩衝稀釋的鬼筆環肽100微升滴蓋滑。 在3和6上可以放置在一個單一的幻燈片。 下一步,將幻燈片在濕度室用鋁箔覆蓋保護熒光光(見圖3)。 將蓋幻燈片在濕度室30分鍾在室溫。

鬼筆環肽治療後,彩色蓋玻片返回他們各自的Petri菜洗三次PBSA Triton洗滌緩衝液(每5分鍾洗)。 蓋上皿蓋用鋁箔或鋁烤盤(防止光)和緩慢旋轉的細胞,他們被洗滌在軌道搖床轉速每分鍾5-10。

DAPI和菁核counterstains,加入稀釋的染料在PBSA到培養皿和治療的貼壁細胞的推薦時間:5-10分鍾DAPI;15-30分鍾菁染料(保護鋁箔光)。 當使用Hoechst或SYTOX汙漬(30分鍾的孵育),先洗細胞漢克斯平衡鹽溶液三緩衝交流之前,複染。

濕度室結構

與PBSA或漢克斯平衡鹽溶液洗滌染色細胞(取決於核染料)三次,每5分鍾洗。 從保護鋁箔光。 徹底清洗在這個階段要刪除所有的痕跡,未結合的鬼筆環肽是必要的(或phallacidin)。

為了去除多餘的鹽分,洗滌細胞三次,2~3分鍾(每洗)在蒸餾水。 請注意,這一步是必要的如果蓋玻片被風幹過夜之前安裝。

最後的蒸餾水洗滌步驟之後,小心地取出蓋玻片用鑷子從培養皿,擦去多餘的水從背麵和邊。 精益的蓋玻片上培養皿蓋兩側對標記,讓他們幹通宵。 保護幹燥蓋玻片與鋁烤盤的光。 幹燥後,將蓋玻片(細胞的一麵朝下)在幹淨的載玻片使用適當的安裝介質。



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