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尼康顯微鏡超分辨率顯微鏡的分子密度

2014-10-04  發布者:admin 

必須以單分子超分辨率成像被認為是關鍵的方麵是每個單獨的定位測量的精度,這已被定位於最終圖像(通常被稱為分子密度探針的密度,和標簽本身的物理尺寸。分辨率和單個分子的定位精度之間的關係容易地確定。解決兩種熒光分子作為單獨的實體的能力是由定位精度,這就決定了每個分子的位置(和不確定性),從而所述一對之間的距離的限製。定位的精度,進而,主要取決於在一個單一的激活失周期從熒光分子收集光子的數目,所提供的背景噪聲可以忽略不計。這種互動式的教程探討分子密度和圖像分辨率的概念。

 

本教程初始化了尼康顯微鏡一組定位點在窗口稀疏,代表在一個虛擬的樣本低程度的分子密度。為了操作的教程,使用局部分子密度滑塊增加局部分子的數目,並因此出現在窗口中的圖像的分辨率。在最高的分子密度,很好的標本細節變得明顯。一種新的樣品可以使用下拉菜單來選擇。 

分子密度和最終圖像的分辨率之間的關係是在奈奎斯特采樣定理,這要求每解析單元大約兩個數據點而言最好的說明。在將標記效率(在效果的指標分數被標記的)的試樣的情況下是不夠的,工件如不連續精細結構細節可以出現在超分辨的圖像。必要局部熒光探針因此,對於具有尺寸α的空間特征的二維圖像時,所需的最小的分子密度,以滿足奈奎斯特準則是:

Nyquist Molecular Density ≈ (2/α)2(1)

因此,例如,為了實現20納米的分辨率在兩個維度,一是熒光團必須位於至少每10納米,並且需要為每平方微米約10,000個分子的一個非常高的分子密度。對於超高分辨率的三維空間,20納米的分辨率要求每立方微米約一百萬的熒光。在實踐中,低得多的分子密度常常是足夠的,當試樣的幾何形狀考慮在內。生物結構往往異構使得即使具有相對高的豐度靶位點的飽和度標記可導致較低的總密度。在一般情況下,熒光探針的足夠的密度必須存在,才能充分映射的標記結構的精細的細節。用相同的標準,這些熒光探針的足夠數量必須成功地在成像過程中的局部。

在單分子超分辨成像的分子密度

在單分子的超分辨技術通過采用光開關的熒光團(例如PALM和STORM)在時間上分離的熒光發射,的開和關的切換動力學的比率是一個重要的實驗參數應該是微調的分子密度。在上麵描述為每平方微米萬的熒光團的分子密度,以實現20納米的橫向平麵上的最終分辨率的情況下,大約600個​​熒光團必須駐留在點擴散函數的橫向投影。這種高分子的密度可以通過一個事實,即大多數光開關熒光團都沒有在他們的暗狀態,從而導致高背景噪聲而變得複雜。這些熒光團或者發出微弱熒光,或者它們可以自發地切換到熒光狀態,在完全不存在激活的照明。非特異性的活化可以是自發的或工件可以由成像激光誘導。在情況下,分子的密度非常高,大量的非特異性激活的熒光團可以生成單分子圖像重疊,從而影響到實現高精度定位的能力。因此,建議采用了具有低暗態排放,低非特異性激活率光開關的熒光。 

示於圖1是涉及影響在單分子超分辨率成像的空間分辨率的最關鍵因素之一,一個重要的概念。該決議與分子密度圖1表示為一係列黃色像素的測試圖案。可能存在於樣本的特征進行成像以逐漸降低的信號 - 噪聲比作為分子密度減小(從底部到圖1的頂部)(測量像素的分數),這些功能變得不可解析時的平均分子分離方法的特征尺寸(圖1中最上麵一行)。因此,如公式(1)中,為了實現在尺寸n倍更高分辨率D,ND倍的像素必須被獲取的。為了不影響任一所述成像速度或信號 - 噪聲比,信號采集速率(每秒檢測到的光子)來實現這樣的分辨率增益必須由至少ND,這需要的因子增加ND倍高暴露於每個圖像的激發激光必需的。 

中的時間分辨率來說,單分子基礎的超分辨率的方法不直接產生一個圖像,而是被用於映射個從數千的個攝像幀確定的特定分子的本地化。在這種情況下,時間分辨率是由所需要獲得合適的圖像成像的幀的數目來確定。此外,Palm和暴風影音成像用於光開關的熒光基團的性質,可對時間的成像速度的限製。熒光蛋白是優良的,用作在例基因編碼的探頭,其中定位於特定的亞細胞區室或生物分子的裝配是必需的。然而不幸的是,熒光蛋白顯示出相對緩慢的光控動力學相比,許多合成的探針,如Cy5標記和Alexa Fluor647,後者可以表現出高開關速度,使1毫秒的攝像周期在大約30納米,這是一個高分辨率的幅值大於那些熒光蛋白獲得的幾個數量級。開關周期的速度,以幫助確定單分子超分辨率顯微鏡的時間分辨率將是在適應這種方法活細胞成像的終極限製。



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