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尼康顯微鏡平衡電弧放電光源激發照明

2014-10-07  發布者:admin 

  微調的熒光顯微鏡的激發光譜成像雙或多標記的標本可以用分濾波器容易實現 激發平衡器 ,其中包含串聯shortpass和長通幹擾,轉換的照明光圈調整弧放電燈的波長分布輪廓濾波器。 這種互動教程探討尼康Eclipse I係列激發平衡器係統影響的熒光發射強度的多標記樣品時,采用雙重和三重激發帶濾波器的組合結合。

本教程以初始化出現在樣品圖像窗口中隨機選擇雙重或三重熒光標記的樣本圖像。臨近這個窗口是一個頻譜圖題為激發通帶光譜圖,其中顯示了用於染色的標本以及在照明光圈激勵均衡濾波器組合的近似傳輸率(白線)的熒光團的吸收光譜(見激發平衡器圖)在可見光譜區。在熒光探針和它們的目標被確定為每個試樣中的教程窗口的左下部旁邊的一個彩色條,與在該激發通帶曲線的激發光譜曲線的顏色相一致。圖表上的個別光譜曲線可被打開或關閉使用適當的熒光團的複選框。新的標本可以被加載到使用選擇的樣本下拉菜單教程。 

為了操作的教程,使用光圈位置滑塊轉移激發平衡器(在激發平衡器說明在本教程的右下角部分圖)的長通和shortpass地區之間的顯微鏡光圈。當滑塊被轉換為最左邊的孔移動到平衡器與激發通帶變化的shortpass區域類似於一個shortpass過濾器的信息。檢體的圖像也變化,以反映熒光強度的來自具有在較長波長區域發射光譜探針的損失。移動滑塊到最右邊移動光圈到長通區域,並產生了激發通帶圖形和標本圖像的相應變化。在這兩個極端之間的是混合區域的激發通帶類似的兩個截止濾光片的混合(如做標本的圖像)。 

尼康顯微鏡Eclipse i係列熒光照明器勵磁平衡係統使顯微鏡使用具有雙重或三重激發濾光片組合的光塊時微調激發波長頻帶的照明光圈最大的效率。此功能是有用的,以在包含多個探針,例如,減少從一個探針的熒光發射,同時增加以優化觀測和數字圖像的記錄的另一個的強度試樣調整單個熒光強度。標本染色,具有兩個或更多的熒光團通常表現出不相等的熒光發射強度值,由於多種因素,其中包括不相等的量子產率,overstaining或understaining,膜的滲透性不足,阻擋差,定影劑掩蔽的抗體結合位點,低固有抗原的濃度,並簡單的熒光團和第二抗體混合的錯誤。激發平衡器可以幫助減輕這些標本的熒光信號的不平衡。

尼康激發平衡器由一個包含兩個薄膜幹涉塗層的作用,可以是長通或shortpass過濾器(或兩者的混合物),這取決於在該光具組的窗口的位置的長方形狀的光學玻璃窗口,如圖教程和圖1中的矩形過濾器被安裝在位於相鄰的顯微鏡照明孔徑光闌,它被包含在一個可移動的殼體,插入到顯微鏡落射熒光照明器(稱為數字成像頭在尼康的滑塊Eclipse的i係列顯微鏡)的視場光闌的光學路徑的前麵。的光通過激發平衡器和激發照明的數值孔徑的量可以通過調節孔徑光闌的大小來控製。當觀察overstained標本,過度熒光發射通常可以使用在與中性密度濾光片組合和由收縮孔徑光圈大小的激發平衡器降低。 

如圖1中所示是長通(黃色曲線)和shortpass(紫色曲線)激發平衡器濾光片的光譜曲線,連同三個熒光團(DAPI,FITC和德克薩斯紅)相匹配的濾波器的特性的歸一化吸收光譜組合。在實踐中,尼康激勵均衡濾波器組合滑塊是由拉或推的幀處理,從而暴露的激發光不同的楔形截止濾光片的混合物被翻譯過的照明光圈。當滑塊定位,使得該照明光圈與激發平衡器(紫色曲線下麵積)的shortpass部重合,僅通過來自照明用下麵520納米的區域的吸收光譜曲線熒光團會被激發到一個顯著度電弧放電燈。當滑塊移動到激發平衡器窗口的相對端,所述長通的薄膜過濾器部(黃色曲線下的麵積)是由孔徑照射,以激發具有波長大於430納米的熒光探針。需要注意的是熒光團,如FITC和Alexa Fluor488,具有在藍色光譜區(450-500納米)的激發帶被激發以高度的效率,無論激磁平衡器位置的。 

當在顯微鏡的照明孔徑被定位在包含兩個長通和shortpass過濾器的部分“混合”的區域中,激發效率而變化為具有在紫外吸收帶和可見光譜的黃綠色區域的熒光團。如在該照明光圈前麵的拉頭的一部分由含有專門的shortpass幹涉濾光器成含有兩個濾波器的比例相等的區域的區域被翻譯的,吸收紫外線的熒光團的吸收效率為約100%至50%持續下降。同時,吸收綠光的熒光團的吸收效率穩步增加,從零到50%,而該吸收藍光的熒光基團保持不變。當滑塊運動持續到含有較大的長通濾波器的比例地區出現了相反的效果。在這種情況下,吸收紫外線的熒光團的吸收效率下降,從50%到零的吸收綠光的熒光基團的增加,從50%的效率為100%。再次,激發在藍色區域的熒光團的吸收效率保持恒定。

各種常見的熒光團,包括Alexa的熒光染料,酞菁染料(在CYX係列),BODIPYs,熒光蛋白,MitoTrackers,SYTOX核酸汙漬和許多傳統的合成和天然探頭可以組合使用的激勵與均衡在雙迎刃而解或三重激發濾片集。例如,在一係列的圖像,如圖2中說明沾上的Alexa Fluor405(微管),SYTOX綠色(核)和德克薩斯紅(絲狀肌動蛋白網絡)瑞士白化小鼠胚胎細胞單層培養和成像用DAPI -FITC得克薩斯紅三重過濾組合使用激勵平衡器。在圖2(a)中,激發平衡器滑塊位於與shortpass薄膜濾波區域中的照射孔徑的前麵,以優先激發的紫光和藍光的熒光團(的Alexa Fluor405和SYTOX綠)。平移滑塊進入激發平衡器(含有兩個濾波器的比例相等)的中心區域產生含有來自所有3的熒光(圖2(b))的圖像。最後,移動滑塊到含有長通濾光片的區域(圖2(c))的消除了紫色熒光團,得到由熒光團(SYTOX綠和德克薩斯紅)興奮的可見光的藍色和黃綠色區域產生的圖像光譜。代替DAPI-FITC-德克薩斯紅三重激發帶濾波器組合與一種設計用於DAPI,FITC和TRITC會產生類似的結果,但對於具有吸收曲線從黃綠色轉變為綠色熒光優化(TRITC與德克薩斯紅)的波長。

激發平衡器也非常適合分離含采用了時下流行的雙帶通濾波器的激勵組合,如DAPI-FITC,FITC-TRITC和FITC標記的得克薩斯紅兩種熒光探針樣品熒光發射。圖3示出幾個例子。圖3(a)是小鼠小腸沾上核探針的Hoechst33258(藍色熒光)和Alexa Fluor 488綴合到鬼筆環肽(綠色熒光)通過與的shortpass部分的雙過濾DAPI-FITC結合成像的薄組織切片在該照明光圈前麵的激發平衡器來激發兩個熒光團。平移激發平衡器入長通區域(圖3(b))的消除了紫外線吸收核染料(Hoechst的33258)。采用這種方式,激勵均衡器是用於控製在已經overstained核標本的熒光發射非常有用。 

耦合到藍色和綠色的雙激發濾光片組合(FITC-TRITC和FITC-德克薩斯紅),激發平衡器可用來控製從樣品標記有熒光團的吸收在通過橙色波長範圍內的綠色發光強度水平。示於圖3(c)是印度麂鹿沾上的Alexa Fluor555(橙色熒光)標記的鬼筆環肽對,和Alexa Fluor488的皮膚成纖維細胞中的貼壁單層培養的圖像共軛的山羊靶向抗過氧化物酶的抗小鼠抗體膜蛋白(PMP-70)的初級抗體。使用FITC-TRITC雙波段激發濾光片組合設置與激發平衡器定位成使得長通薄膜濾波區域與照明孔徑一致的圖像被捕獲。平移激發平衡器到shortpass區域(圖3(d))的減少(或消除)從吸收綠光的熒光團(的Alexa Fluor555)的熒光發射。類似地,FITC-德克薩斯紅濾波器產生類似的效果(圖3(e)和圖3(f))的。在後兩個幀中的檢體是標記的Alexa Fluor594綴合的鬼筆環肽(肌動蛋白)和的Cy2偶聯的靶向小鼠抗-α-微管蛋白的一抗的二抗大鼠胸主動脈細胞培養物。



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