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尼康顯微鏡色差和光暈環相差偽像

2014-10-21  發布者:admin 

兩個在相位對比圖像觀察到的非常常見的效果與特征色差和光暈圈圖形,其中所觀察到的強度並不直接對應於檢體和周圍介質之間的光程差(折射率和厚度的值)。這種互動式的教程演示正負相差顯微鏡色差的文物。

本教程以初始化出現在半透明的藍色矩形試樣在窗口的左側。相鄰的標本是一個模擬相襯視場(有權理想人格形象,直至色差滑塊翻譯)描述如何樣的姿態出現在理想的無偽影的情況下,在尼康顯微鏡。在窗口的右手側是橫跨沿著x軸試樣的中心所取的線強度的掃描曲線圖。該掃描顯示了相對於所述背景樣品的強度分布。

為了操作的教程,使用鼠標光標移動到翻譯色差度滑塊到右邊,這將增加該神器的嚴重性。作為色差截止值增加,在色差圖像窗口中的試驗片的外觀被改變,以反映改變的標本圖像。增加色差和光暈工件的水平再分配強度在試樣的中心,並產生周圍光暈。同時,該線強度的掃描信息被改變,以與改變的標本圖像對應。標本的對比,可以進行正相襯,負相襯的單選按鈕之間進行切換逆轉。

雖然色差和光暈型態發生的相位相反的光學係統的自然結果,它們通常被稱為相位偽影或圖像失真。在所有形式的正相位相反,明亮的相光暈通常包圍大樣本的特征和介質之間的界限。相同的光環似乎比負相襯光學係統的樣本顏色較深。這些效果是由光程差的波動,它可以變成明亮的暗光暈正相襯,明亮負相襯暗光暈進一步加劇。

光暈圈出現在相差顯微鏡下,因為位於物鏡相板的環形相位延遲(和中性密度)環也發送一個小的程度衍射光從檢體(它不局限於僅通過環繞波)。該問題是由以下事實的零階環繞的波陣麵投影到相板由聚光環帶的寬度比所述相位差板環的實際寬度小複雜。在相位環和環繞的波陣麵之間的寬度之差,通常是大約25%至40%,但是必要的,因為限製和光學設計的要求。因為在物鏡衍射麵的相位環的空間位置,隻有那些對應於由樣品衍射的低空間頻率的波前穿過相板的環狀空間。因此,通過相位板衍射試樣波保持90度(四分之一波長)進行相對相位的零階(undeviated或環繞)的光。所得到的相位相反光暈工件是由於衰減的通過一個非常小的角度相對於該零階環繞的波陣麵的衍射由樣品中的低空間頻率信息。實際上,不存在由樣品和undeviated光波衍射低空間頻率的波陣麵之間的相消幹涉的產生一局部對比度反轉(由光暈表現)周圍的檢體。為了創建該圖像的銳利邊緣,所有的試樣衍射的空間頻率,必須在最終圖像來表示。

相襯光暈特別突出和顯著四周大,低空間頻率的物體,如細胞核,矽藻和整個細胞。另一個因素為光暈工件是光能量在圖像平麵上的重新分布,從地區,它是破壞地區,它是建設性的。大,高對比度光暈可以為試樣產生大的光程差,如紅細胞,黴菌,原生動物,酵母細胞和細菌產生混亂的圖像。另一方麵,光暈效果往往強調試樣和其周圍的背景之間的對比度差異,並能提高在許多樣品的薄邊和邊界的信息的可視性。這種效應是負相位相反,從而產生周圍的低頻圖像細節的暗暈特別有幫助。在許多情況下,它能夠減少相移和衍射的程度,導致周圍的樣品降低光暈的大小。最簡單的補救用於除去或減輕光暈的強度是修改具有較高折射率的成分,如甘油,甘露糖醇,葡聚糖,或血清白蛋白的觀測介質的折射率。在某些情況下,改變介質的折射率甚至可以產生反轉圖像對比度,把暗標本設有明亮而不顯著幹擾背景強度。

光暈環效應可通過利用包含周圍的物鏡後孔附近的相位環材料中性密度材料製成的小環專門設計階段物鏡來顯著降低。這些物鏡被稱為切趾相襯的物鏡,使具有大的相位差來觀看和拍照,清晰度和細節的定義階段對象的結構。在大多數情況下,細胞內的功能(如核仁)可以明確識別為具有與已切趾的物鏡暗的對比度,但這些相同的特征,具有明亮的光暈或者被成像為使用常規的相位對比光學亮點。與切趾光學對比度由於衍射光相對於直射光穿過樣品的大振幅扭轉。 

在實踐中,光暈減少和增加樣品的對比度和變跡的光學係統可通過位於鄰近於在後焦麵內置到物鏡的相位板的相位膜的選擇性振幅濾波器的使用來實現。這些振幅濾波器由施加到相位膜周圍的相位板的中性密度過濾器的薄膜。在古典相位板的相位偏移環的透射率約為25%,而對周圍的切趾板的相移圈相鄰的環的具有中性密度以50%的透射率。相位膜的兩個板的寬度是相同的。這些值與相移施加到標準板在相襯顯微鏡的薄膜的透射率的值是一致的。


光暈在相差顯微鏡另一個很常見的光學神器,而且往往是在大,延長階段,標本最容易變化。它通常會被預期具有橫跨直徑恒定的光程長度大的相位標本的圖像會出現均勻的暗或亮的顯微鏡。不幸的是,通過相差顯微鏡產生的圖像的亮度不總是承受由試樣產生的光程差一個簡單的線性關係。其它因素,如吸收的相位板和相位延遲或提前量,以及相位環和聚光環形帶的相對的重疊大小也起著至關重要的作用。一個大的,厚度均勻的正相位對比試樣的強度分布往往逐漸從邊緣到中心,其中所述光強度的中心區域可以接近其周圍介質的增加(相反的是真正的負相位標本)。這種效應被稱為色差,並檢查擴展平麵標本,如材料板(玻璃或雲母),複製品時經常觀察到,扁平組織培養細胞和大細胞器。 

光環和正反兩方麵的相襯色差文物的影響列於圖1為具有矩形幾何形狀,比周圍介質的折射率高一個假想的延長階段,樣品(圖1(a))。通過樣品的中心區域記錄的強度分布示於圖1(b)所示。在正相位對比(圖1(c))中,樣品的圖像顯示出鮮明亮麗光暈和演示了戲劇性的色差效應,這是由逐漸增加的強度從邊緣到該試樣的中心區域遍曆時表現出來(見強度分布在圖1(d))。光環和色差效應已扭轉負相位對比(圖1(e)和1(f))的強度。甲暗暈圍繞標本圖像與負相位對比光學器件(圖1(e))的觀察時,與從明亮的樹蔭斷過渡範圍的邊緣,以更暗的灰度級中的中心。此外,該強度分布(圖1(f))的是從與正相位對比觀察扭轉。 

色差現象通常也稱為區--的動作的效果,因為具有均勻的厚度,在試樣中部區域衍射光不同於高折射區域,在邊緣和邊界。在檢體的中央區域,這兩個相對量和衍射光的角度時相比,邊緣被顯著地減少。因為衍射的波陣麵從中央試樣區域始發具有從零階非偏斜環繞的波前隻有邊際的空間偏差(但仍然滯後於相位由四分之一波長),它們是由在物鏡後方的相位板捕獲焦平麵,伴隨著環繞的光。其結果是,中央檢體區域的強度基本保持相同的背景的。色光降效應在相對平坦的平麵試樣的區域的外觀,連同由邊和邊界產生的過高的對比度提供了強有力的證據表明,相位相反的機製主要是由衍射和散射的組合現象的控製。 

光暈和色差工件取決於兩者的幾何和光學相位板的特性和被檢查的樣品。特別是,相環的寬度和透射率控製這些效果發揮關鍵作用(相位環的寬度通常是大約十分之一的物鏡的總開口麵積)。為減少透光率更廣泛的相位環往往會產生更高強度的光環和色差關閉,而環徑對效果的影響較小。對於一個特定的階段物鏡(或正或負)時,光程差和樣品尺寸,形狀和結構有光暈和色差效應的嚴重性顯著影響。此外,這些效果是由物鏡放大倍數的嚴重影響,以生產更好的圖像放大倍數較低。



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