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奧林巴斯顯微鏡過濾器的彩色攝影

2014-11-02  發布者:admin 

通過顯微鏡拍攝由寬幅意想不到的顏色變化和改變,這會影響該圖像的膠片乳劑或數字電子圖像拍攝設備呈現的光譜複雜化。 這些意想不到的攝像結果由多個因素,從所述光源和所述膜乳化光學工件,例如象差和燈電壓的波動之間不正確的顏色的平衡造成的。

如果膜乳劑和顯微鏡光源之間的色溫差異已被仔細地控製,如在AG亚游集团的討論中描述的色溫 ,那麽小的調整顯微鏡光源的色彩平衡通常能夠減少色移的問題。 在大多數情況下,對於不希望的色彩效果的原因是很清楚的,或者可以很容易地通過仔細研究根據該已曝過光的條件決定。 在其他情況下,該問題是不能立即明顯,並且可能需要進行詳細調查的原因沒有被覆蓋之前。

的彩色攝影的問題的基礎上已經被確定之後,它通常是很容易糾正與適當使用的一種或另一種過濾器。 過濾器用於選擇性地阻止或減少選定波長的強度,同時發送的所有其它部分。 各種過濾器是可商購的協助顯微攝影中,以獲得最高質量的圖像可以補償光學和照明的問題。 許多顯微攝影的色移或石膏可以通過插入適當的柯達雷登色彩補償濾波器插入光路徑進行固化。 其他的過濾器,如中性密度,對比度增強,紫外線吸收,熱吸收,紅外,並設計成協助將出生物汙漬的細節過濾器也經常使用。 這些過濾器將在下麵詳細討論。

過濾器是在玻璃的形式通常可用的,已塗,混合,或浸漬有從天然和合成來源獲得的有機和無機染料的塑料膜的玻璃,乙酸鹽,明膠或堿。 玻璃或聚合物中的過濾器的製造中使用的質量是很重要的,並且應該是光學級,並提供密度和顏色的均勻性,在整個顯微鏡視場。 明膠過濾器是最符合成本效益和良好的光學過濾器可以買到,這使得過濾器的關鍵顯微攝影的首選材料,盡管所需的柔和處理。 光學玻璃過濾器也是極好的,但這些都不是可用的,以滿足所有的顯微鏡的需要。 醋酸濾波器通常用在非圖像形成係統,其中所述需要的質量和精度是不重要的。 通常,乙酸過濾器用於在照相放大機和打印機。 塑料塗層的過濾器,主要用於在暗室安全燈的應用,並且不適合用於光學顯微鏡。 使用由不同製造商的術語可以是混亂的,因為過濾器是由產品號或通過其過濾性能的某些方麵通常稱為。 很少有全行業的過濾器的命名標準。

色彩補償濾鏡 -柯達公司生產的雷登係列專為廣泛的實驗室和工業應用的光譜色彩補償濾鏡。 這些過濾器包括用適合的染料混合並分散在明膠中以達到所需的光譜特性的膠態碳。 色彩補償濾波器從色彩平衡和轉換過濾器的區別在於它們通過減弱主要是可見光光譜的紅色,綠色和/或藍色的區域控製顏色。 它們被簡化為前綴的CC,對於C鼻天鵝Çompensating,接著由濾波器的標稱峰值密度範圍從約0.025到0.5乘以100,並與過濾器的顏色的大寫首字母(例如M代表品紅色)結束。 因此,具有0.3的額定峰值電流密度的縮寫,黃色色彩補償濾鏡是:CC30Y。

在此係列中的每個過濾器控製的單一顏色的同時使1其餘兩種顏色的或兩者的量。 在這種方式中,顏色補償過濾器可以使細微改變光源的顏色平衡,也可以補償在光譜輸出的不足。 對於一個係列的藍色色彩補償濾波器(CC025B通過CC50B)的可見吸收光譜示於圖2中的主要最小值出現在範圍380-490納米的為在此係列中的所有過濾器,其通過最藍的波長和過濾綠,黃和紅色的波長時置於奧林巴斯顯微鏡的光路中。

色彩補償濾波器被標有號碼(標稱峰值濃度),以指示其吸收光的能力。 最常用的濃度是05,10,20,30,40,和50,其遞增地增加濾光器的光密度從較小(05)更大的(50)的密度。 作為一個例子,一個30號過濾器降低了它的補色的50%,或1曝光步驟的水平。 一個CC30M濾波器(品紅色)吸收綠色光線通過它的50%。 色彩補償過濾器可以組合使用(例如,CC20Y(黃色)+ CC20M(品紅)= CC20R(紅色)),但為了取得最好的效果,應該隻用一個單一的過濾器。 當兩個過濾器相結合時,創建一個稍微不同的顏色,這可以掩蓋顏色缺陷的顯微照片的假象。

一主用途顏色補償濾波器是克服從批內或不同批次之間的變化在膠片的乳劑。 色膜的製造是一個複雜的過程,涉及塗敷無數感光乳劑是隻有幾微米厚的聚合物基體。 在乳劑厚度波動會影響色彩平衡,並且可以顯示在一個或多個單獨的顯微照片,在薄膜的整個輥子,或在一個批次中的一部分。 廠家允許的變動公差相當於一個CC10濾波器,已被證明是可接受的大多數用戶的變化的效果。

臨界顯微攝影決定了可用於小心控製的色移,這可能在的6原色的任一項變化顏色補償濾波器:紅色,綠色,藍色,青色,品紅色和黃色。 大多數情況下,觀察背景顏色上的新的顯微照片,當膜批次變化是第一顯而易見。 這種顏色應該是一個中性的淺灰色或白色,而顏色的變化通常發生時非常明顯。 它是一個簡單的事情,通過使用互補色移存在於背景中的過濾器來校正色彩補償濾光片的色彩平衡。 當使用彩色膠片承擔了沉重的負荷顯微攝影,這是明智的購買電影有每卷相同的乳液號和多餘的儲存在冰箱或冰櫃。 測試輥然後可用於確定色彩補償和平衡的變量,應保持恒定的膜批次的其餘部分。 推薦的步驟是讓沒有補償濾波器的單個幀,然後通過每個CC10係列過濾器(CC10R,CC10G,CC10B,CC10C,CC10M和CC10Y)曝光幀。 在5000κ輕表,它顯示一個幹淨的白色或非常淺灰色背景的背景對準所有7的顯微照片之後是已經被正確地過濾所述一個。

在圖3中所示的顯微照片顯示出使用人下十二指腸組織的曙紅/蘇木精染色的薄截麵的顯微照片的彩色校正過濾器測試。 如圖3(d)示出了在不添加色彩校正濾光片基線色彩平衡。 整體偏黃的圖像顯示,一個CC10G濾波器(圖3(f))的是適當的過濾器進行色彩校正。 實際上,在圖3中的背景(f)為圖3中的所有圖像的最清潔和最純淨,並且表示用於顏色校正的最佳選擇。 其他過濾器(圖3(A,C,E,F,G))產生的背景,在顯微照片讓人聯想到的補償濾波器的色彩。 在光路中放置一個CC10Y過濾器(如圖3(b)),不僅增加了黃色背景的強度。

在許多情況下,低密度顏色補償過濾器可以有效地用來提高在組織薄切片被染色的各種染料的彩色再現。 每個樣品必須在試驗和錯誤的基礎進行評價,由於色彩補償濾波器的過度使用可能導致的互補色斑的顏色劣化和可能使用色調的背景。 一般最好限製在嚐試使用它們來提高色斑的顏色時顏色補償過濾器的密度低於CC20。

所建議的約翰·G·德伊 ,也有以柯達雷登過濾器更便宜的替代品用於顯微鏡的預算,或者當這些過濾器不可用。 柯達也生產包含一組具有0.10,0.20,和0.40的每一個的6種顏色(紅色,綠色,藍色,青色,品紅,黃色)的光密度值的透明濾光器的彩色打印可視過濾器套件 。 這些過濾器可以放置在顯微鏡的光端口上,以提供一個快速簡便的顏色校正。 雖然不製造成相同的臨界公差為雷登或彩色印刷的過濾器中,觀察過濾器通常可以被取代的,如果它們沒有在表麵上嚴重汙點。 柯達還提供了一組醋酸彩印濾光片( 彩色打印過濾器集),這是在75×75毫米正方形提供,並且包含足夠的過濾器來匹配由雷登過濾器提供最密度。

使用下麵的鏈接導航到包含數據的個人色彩補償濾鏡規格頁麵:

  • 色彩補償濾色片數據 -可見吸收光譜和含有主極大的波長的表提供了用於柯達雷登係列顏色補償濾色片家族。

中性密度濾鏡 -當顯微鏡照明太亮了舒適的觀察和顯微攝影的情況下,光照強度應通過使用中性密度濾光片,通常被稱為ND濾鏡減少。 這些過濾器是中性灰色顏色和設計是均勻地減小的透射光強度跨部分或整個波長範圍,而不會引入在色溫的顯著變化。 中性密度過濾器是理想的,用於控製彩色顯微照片,曝光時間,而調整燈電壓。 在光學顯微鏡的主要用途就是延長曝光時間的情況下,燈的強度是如此之大,由攝影設備所允許的最短曝光超過正確地捕捉圖像所必需的時間。

有兩種類型的中性密度過濾器:吸收和反射的,其通過吸收或反射波長的選擇的頻帶工作。 圖4所示是用於一係列共同的中性密度濾光片的可見光吸收光譜。 如可以被看到的,在圖中,這些過濾器顯示在整個可見(400至700納米)的光的範圍的相對恒定的消光係數。 每個中性密度濾光器增量從ND-0.3至ND-70在圖4中有一個連續的較大消光係數,它們共同用於調節照明提供均勻的一係列過濾器。

中性密度過濾器使用已經浸漬或溶解的材料,以減少光學透明度明膠,聚合物或玻璃基板製成。 柯達雷登中性密度濾鏡是非常受歡迎的,而且都是用專用的明膠薄膜。 含有有機染料的選定補體的膠體碳懸浮液中混合液體的明膠,直到所需的中性密度。 然後這個組合塗覆到支撐玻璃基板上,直到它形成一個非常薄的均勻厚度的膜。 幹燥後,將膜從基板剝離,並塗有清漆以保護。 請注意,即使中性密度,顏色補償,以及其他雷登過濾器由一個漆塗層的保護,但它們仍然suseptible損壞(特別是從劃痕),並應在邊緣處或在彎道中僅處理。 另一種方法是通過將其放置在一個簡單的金屬框架,還銷售柯達保護明膠雷登過濾器。 切勿將過濾器暴露在溫度超過50攝氏度長時間。 同樣重要的是,這些過濾器不能放在過於靠近顯微鏡,以避免損壞的鹵鎢燈光源由於由該燈所產生的熱量。

規格為最常用的中性密度過濾器示於表1。每個中性密度濾光器是由字母數字代碼,ND-XX,其中XX是平均透射光的百分比由過濾器指定。 因此,使用ND-60過濾器發送(或傳送)60%的來自光源和一個ND-0.1過濾入射光的透射入射光的0.1%左右。 中性密度濾光片的光密度根據以下方程定義為吸光度(透射率的倒數)的對數(以10為底):

光密度 (D) = log(A)

在哪裏:

A(吸光度)或不透明度= 1/T (透光率)

和,因此:

D =log(1/T)

其中T是光的百分比正在透過過濾器,D是光密度,A為吸光度。 大多數顯微鏡參考密度,而不是不透明度(透射率倒數)與中性密度過濾器時。 這可能是更合適的,因為人眼感知對數標度的光強度的差別。

中性密度濾光片可以堆疊在一起,以實現對其中不存在過濾器的密度值。 堆疊這些過濾器是附加的,使得把一個ND-50(密度= 0.3),並和ND-60(密度= 0.2)過濾到光路徑相當於一個ND-30(密度= 0.5)過濾器的這種放置。 以0.30的密度的過濾器具有50%的(ND-50,表1)的透射率,因此,它可以用來通過兩個因素來減少顯微鏡燈的強度。 同樣地,具有0.6的密度濾光器(ND-25,表1),具有25%的透射率值(減少了四倍燈強度),和密度1.0(ND-2.0,表1)的一個過濾器可以以10(10%透光率的值)的係數降低燈光強度。

如前麵所提到的,調整曝光在顯微攝影中是的主要目的為使用中性密度濾光片之一。 許多現代的顯微鏡都配有液晶屏幕顯示的通知的曝光時間操作的快門速度可達百分之一秒的曝光監測。 這些顯示器通常也允許在1/3到1/2檔光圈的增量調整曝光。 在一些情況下,使用具有高能量鹵鎢燈明照明時,特別推薦的顯示器的曝光時間小於0.05秒。 這是一個非常短的時間,這會導致圖像的曝光和漸暈不足。 加入ND-50中性密度濾光器的光路將必要的曝光時間增加一倍至0.1秒,而一個ND-25過濾器會增加曝光到一個舒適的0.2秒。

中性密度濾光片規格
稱號密度傳輸 
(百分比)
ND-800.180%
ND-700.1570%
ND-600.260%
ND-500.350%
ND-400.440%
ND-300.530%
ND-250.625%
ND-200.720%
ND-160.816%
ND-130.913%
ND-101.010%
ND-12.01%
ND-0.13.00.1%
ND-0.0140.01%
表1

調整曝光用中性密度過濾器的能力,對於具有固定的快門速度的攝像機尤其重要(這些速度範圍為約1/500秒至幾秒),其中每個連續的速度增加曝光由一個雙重的增量。 例如,曝光表可建議為一個快門,其具有最大的速度有限,以1/250秒的1/1000秒的快門速度。 通過將ND-25中性密度濾光器在光路中,燈的強度被有效地通過四個因素減少,增加建議的曝光時間1/250秒。 實現更加舒適的快門速度,使用ND-2.0過濾器,以提高曝光時間0.1秒。

中性密度濾鏡也可用於橫亙2快門速度的曝光是有用的。 在一個情況下的1/125秒的快門速度是太短了,但1/60秒太長,中性密度過濾器可以被放置在光路中,調整照明容納在這兩個值之間的曝光。 甲ND-60,ND-70,或ND-80過濾器一起使用的1/125秒的快門速度將增加1/3到的f-停止於曝光時間的2/3,使得在曝光更寬容度。 的實際曝光,必須通過反複試驗來確定的,但中性密度濾光片應常規用於調節曝光時間上的固定快門速度的相機。 要小心,不要通過使用中性密度濾鏡介紹很長時間曝光,因為這可能會導致互易律失效和相關的色彩平衡假象。

較舊的中性密度過濾器可以獲取微黃色調隨著年齡的增長,以及一些較便宜的過濾器也具有一定程度的背景顏色。 如果引進的中性密度濾光片在光學通路導致不正確的色彩平衡的顯微鏡,經過精心校準,使用色彩補償濾鏡顯微鏡光源返回到其適當的平衡。 其它光學因素,如內部散射和反射,可影響中性密度濾光片的有效密度,導致它們從測量的密度而變化。 出於這個原因,它以校準中性密度濾光片臨界顯微攝影是重要的。

過濾器被弄髒試樣 -生物組織的薄切片進行染色,通常用一種或多種有機染料,以選擇性地增強的標本中存在的各種特征的可見性。 強度和大多數生物組織產生的汙漬將重現很好的彩色膠片的色調,但有些汙漬往往會顯得模糊或有自己的顏色轉變,尤其是在多個染色的混合物。 在許多情況下,顏色補償過濾器可以幫助恢複大部分或全部丟失的顏色,但過多的過濾可能會影響相鄰的染色特征和背景的顏色。 出現此問題的與流行的汙漬曙紅,品紅和亞甲基藍,這是不複製在大部份的彩色膠片。 通常,組織染色,這些染料,它們可以單獨或以混合物出現渾濁和缺乏色彩飽和度。

為了抵消這種效果,顯微鏡采用釹鐠過濾器 ,它含有溶解在玻璃稀土元素的組合。 釹鐠混合物過濾除去一部分可見光譜的桔黃色區域的,一個效果,即增加在試樣棕色,藍色和紅色染色的特征的色彩飽和度的強度。消光係數是最高的580和590納米的釹鐠過濾器之間,從而使過濾器,以除去大部分的橙色和黃色的顏色往往暗紅色和藍色調的染色薄切片。

如圖5中所示兩種顯微照片同一試樣,薄沾上曙紅和蘇木精的混合物人胰腺的部分。 在左側的顯微照片(圖5的(a))是在沒有顏色補償濾波器的益處或釹鐠混合物過濾。 在右側(如圖5(b))是相同的視場的圖像時,此時用插入到光路中的釹鐠混合物過濾。 注意在顏色飽和度,在此顯微照片,紅色和藍色色調的急劇增加。

釹鐠混合物過濾產生於非常薄的玻璃部分的厚度一至兩毫米的,因為光線被過濾器所吸收的量取決於過濾器的厚度。 較厚的鐠釹過濾器可以引入文物,如彩色背景和其他汙漬的顏色退化。 大多數主要的顯微鏡製造商提供適當的尺寸作為選購附件的鐠釹過濾器。

在某些情況下,生物樣品的背景可以成為輕輕染色過程中,不希望的偽像中著色。 為了避免這種情況,彩色補償濾波器可用於減去背景顏色,隻要不是過飽和。 與染色薄切片的另一個問題是在安裝介質的著色。 加拿大香脂,一個流行的用於製備薄切片中,通常會變成淡黃色隨著年齡的增長或整裝標本。 一個藍色的色彩補償濾鏡(CC10-20B)通常會解決這個問題,除非該標本是一本很厚整裝。 在這種情況下,有可能無法完全中和的黃色色調。

紫外線過濾器 -鹵鎢燈顯微鏡不發射一個顯著量的紫外線,但有些除了汞和氙氣燈的較新的鹵鎢燈產生在300-400納米範圍內的一個相當大的量的紫外線。 紫外線輻射可露出感藍乳劑層中的許多彩色膜,導致整體的顯微照片,有一個偏藍。 這主要是用熒光顯微鏡中的問題,但它可以通過使用高強度的鎢 - 鹵素,汞或氙燈發生在任何顯微鏡。 為減少紫外線照射,使用柯達雷登2B2E過濾器,吸收低於390和415納米的紫外線輻射,分別。 該2B過濾器將刪除幾乎所有的紫外線的波長,隻留下可見光照射試樣。 具有阻斷的波長較大的頻譜時,2E濾波器也會除去一些紫色和波長較短的藍色光,因此該過濾器是不理想的彩色顯微攝影。

紫外線對彩色攝影的影響示於圖6的圖像的左側(圖6的(a))示出了曙紅 - 蘇木在人結腸上皮細胞染色的粘液分泌的管狀腺薄膜部。 有一個整體偏藍到彌漫大多數樣品的特征和背景的顯微照片。 放置一個柯達雷登2B濾光鏡插入顯微鏡光路中後,在右側的圖像(如圖6(b))得到。 請注意,此顯微照片顯示出更好的色彩飽和度和消除偏藍的清潔背景。

閃光燈管也可產生一個相當大的量的紫外線,並且可能需要使用一個濾波器,以去除不想要的波長。 許多現代的透明薄膜的顏色進行日光照明平衡含有吸收紫外線的掩膜作為薄膜層中的一個。 在這種情況下,使用的過濾器可能是沒有必要的。 它是讀取在每一個新的電影類型製造商的規格表,以確定是否它是通過紫外線光阻擋層保護的一個好主意。

熱吸收器 -幾乎90%的鎢或鎢-鹵燈發射的輻射發生在紅外波長的形式,這是與生產相關聯的熱。 汞和氙弧燈也產生了相當多的熱量。 吸熱過濾器可以被添加到所述顯微鏡的光路附近的照明器,以除去不需要的紅外波長和保護顯微鏡的光學部件,過濾器,並從熱損傷試樣。 事實上,大多數主要的顯微鏡製造商提供吸熱過濾器作為標準配置,有的甚至將這些過濾器進入照明。 如果你懷疑你的顯微鏡照明可能有一個內置的吸熱過濾器,請查閱使用手冊或聯係您的樂器經銷商。 許多OEM照明散熱過濾器不能輕易拆除,應留在原地。

一些吸熱濾光器從硼矽玻璃的一種特殊類型稱為Aklo,其吸收紅外線的熱射線,並且是綠色或藍綠色的顏色製成。 與Aklo製成的過濾器可能會引入色彩平衡偏差為顯微照片。 此副作用可以用顏色補償過濾器,互補的吸熱濾光器的顏色進行校正。 如果熱過濾器可以從燈殼被除去,這樣做並檢查它在5500κ輕表。 淺綠色的熱量過濾器可以通過一個CC10M或CC20M品紅顏色補償濾波器來補償,而藍綠色的熱量過濾器可以通過一個淡紅色(CC10R或CC20R)濾波器來補償。 將互補的過濾器上的熱量過濾器的頂部,直到發現了正好平衡在熱過濾器中的色調和曲折的顏色中性。 當插入顯微鏡光路中,該補償濾波器應減輕色彩平衡問題。 一些較新的顯微鏡有二色性幹涉濾光片設計,以反映熱退入燈箱。 二向色濾光片,遠遠地阻擋熱比石英或玻璃吸熱過濾更有效,並且不會產生裂紋或斷裂時,一個顯著量的熱被吸收。

為了利用在彩色攝影濾波器的全部潛力,在顯微鏡必須具有的過濾器,可見光,和膠片的乳劑間的相互作用的技術方麵的完整的理解。 當過濾器被正確地用於解決色移和平衡問題的彩色顯微照片的質量有很大的提高。




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