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尼康顯微鏡標本的光學路徑長度變化

2014-11-23  發布者:admin 

相差顯微鏡解釋為波動的光強度,這是很容易觀察到的變化在通過尼康顯微鏡的對比度在樣品光路長度的差異。此交互式教程探索對表觀總光路長度的折射率和厚度的變化的影響,並說明了兩個試樣如何能有這些變量的不同組合,但仍顯示相同的路徑長度。

教程初始化與兩個試樣(由灰色框表示)出現在窗口中,每一個都具有相同的光路的長度,但具有的折射率和厚度的不同組合。雙相幹平麵波前 (題為波在階段)入射到試樣的左側麵,並根據由所述滑塊設置為它們穿過變量的相位被修改。在離開樣品時,波前可在相當兩個樣品的光路長度大致相等,或異相,如果路徑長度差超過一個多微米的十分之幾。波前是藍色的,當他們在階段,但變成紅色時移出的相位。此外,該試樣被假定為通過空氣,其具有1.00的教程的目的折射率包圍。需要注意的是波前穿過樣品的實際數目是誇大為了便於說明。

為了操作的教程,使用鼠標光標來翻譯折射率試樣厚度滑塊的頂部和底部樣品。當滑塊值被改變,所產生的試樣光路長度(它等於折射率乘以厚度)的變化。試樣盒的灰度強度也降低(變暗)作為折射率增加。雖然大多數滑塊值將導致穿過成為異相(和標題為標本的波浪吹出階段)中,在滑塊設置若幹組合會產生相同的樣本的光路長度,其中離開所述兩個試樣的波是同相的。訪問者鼓勵嚐試各種滑塊設置,並觀察了廣泛的折射率和厚度的值可以導致具有相等的光路長度的試樣。另外,在相對 於實際試樣尺寸的波前的尺寸被誇大了為了便於說明,在教程。

在試樣和其周圍的介質之間的光程差來說,與入射光波前橫穿檢體,但不穿過周圍介質的所述部分,稍微延遲。在相差顯微鏡參數,試樣中改變的光路長度中的作用(在效果的相對相移)波通過的是非常重要的。在經典光學,光路長度(OPL)通過一個對象或空間的折射率(n)和所述對象的厚度(t)或所描述的關係居間介質的產品:

光學路徑長度(OPL)= n × t

當光從一種介質傳遞到另一種時,速度成比例地改變,以在兩個介質之間的折射率差異。因此,當通過聚焦顯微鏡燈絲發射的相幹光波通過具有一定厚度的相位標本和折射率(Ñ),該波被增加或在速度降低。如果試樣的折射率大於周圍介質的,所述波在通過檢體並隨後被阻滯在相對 相位它出現時,從檢體減少速度。相反,當樣品的折射率小於周圍介質,該波是在離開試樣高級同相的。在試樣和周圍介質之間的突發波前的位置的差被稱為相移δ)和以弧度為定義為:

δ = 2πΔ/λ

在上麵的公式中,術語Δ被稱為光程差,這是類似的光路長度:

光程差(OPD)= Δ = (n2 - n1) × t

其中n(2)為試樣和的折射率n(1)周圍介質的是折射率。在正相位對比係統(其中所述非衍射光的波前由相位板中高級)時,如果樣品具有更大的光路長度(較高的折射率)比周圍介質,它被成像為暗物體上的中性灰色背景。當周圍介質具有比試樣的折射率高的情況是相反的。實際上,試樣出現明亮的上一個暗的背景。

如上所證實,該光程差導致的兩個項的乘積:試樣的厚度,並且其折射率與周圍介質的差異。在許多情況下,光程差可以是相當大的,即使在試樣的厚度是小的。另一方麵,光程差可以是零,甚至對大試樣的厚度,當樣品的折射率等於該周圍介質。

對單個細胞在組織培養中,光程差是比較小的。單層培養的典型小區具有大約5微米的厚度和大約1.36的折射率。該小區由具有1.335的折射率,從而產生出含有0.125微米的光程差,或約四分之一波長的營養培養基包圍。亞細胞結構產生更小的相位差。這些小光程差產生的強度的線性減少而增加的相移(該圖像逐漸變暗生長)到一個點(取決於相位板配置),在這之後,檢體的圖像變成通過反轉對比度亮。在相差顯微鏡,圖像的強度不承擔由檢體的整個厚度和折射率範圍所產生的光程差一個簡單的線性關係。相反,強度是取決於各種因素,包括吸收在該相位板,相位提前或延遲的相位板的程度,而這種相移的相對符號。




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