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徠卡顯微鏡重新重組玉米抗體

2018-03-29  發布者:admin 

種子提供用於生產重組蛋白質和它們的許多優點的一個有用的和多功能平台已經經常討論。其中種子,穀類作物提供了額外的優勢,如高收益和良好的配合建立的農業基礎設施,可以方便地上下縮放響應需求。另外,穀類胚乳自然適於蛋白質積累,有酚醛樹脂,生物堿和草酸,這是眾所周知的幹擾蛋白提取和下遊加工的一個相對簡單的種子蛋白質組和低含量。玉米的穀類作物中最高全年糧食產量和它的內核尺寸比其它穀物更大,因為胚乳組成的種子82%。玉米轉化是公配合建立和幾個充分表征胚乳especific和種子限製啟動子係統可用於轉基因表達的控製。值得注意的是,第一個商用來自植物的重組蛋白(抗生物素蛋白和β葡萄糖苷酸酶)是由ProdiGene基因公司(學院站,TX,USA)生產的玉米和纖維二糖水解,酶用來從生產生物燃料植物生物量,已經表達了對玉米種子總可溶性蛋白(TSP)的高達30%的產率。


定的優點。如上所述,玉米是有利的穀物作為用於大規模生產抗體,如在病毒中和抗體2G12已經在玉米的種子已成功地生產的平台之間,達到75微克/克的產量。2G12抗體識別在人免疫缺陷病毒1(HIV-1)的包膜糖蛋白gp120包膜蛋白oligomanose型聚糖,被認為是一個有希望的殺微生物劑。

玉米種子積累無論在蛋白貯藏液泡並在蛋白質體直接從內質網衍生的蛋白質。玉米醇溶蛋白(α-,γ-和δ-玉米醇溶蛋白)聚集在蛋白質體,其包含的α-和δ型玉米醇溶蛋白的中心纖芯和γ-玉米醇溶蛋白一peripherical層。的玉米醇溶蛋白相互作用非共價地,但也交聯通過分子間二硫橋,特別是γ-玉米醇溶蛋白它們是富含半胱氨酸和形成引發蛋白體的形成共價鍵聯的多聚體的聚集體。形成二硫橋的這種能力,連同在玉米胚乳玉米醇溶蛋白的豐度(高達在成熟種子總蛋白質的50%)使得它有可能該重組蛋白如抗體的存在,這也形成分子間二硫鍵橋將促使低聚物的形成。抗體鏈共價連接於γ玉米醇溶蛋白不會被反映在2G12抗體的產率以前報道下列鹽水萃取。AG亚游集团建議,玉米作為可溶性重組抗體的表達平台的潛力,可以增強在玉米品種與內源性γ玉米醇溶蛋白的水平較低。

材料和方法

轉基因玉米種子表達2G12攜帶,用來指導抗體鏈插入內膜係統,但沒有進一步的靶向信號被固定在4%多聚甲醛和0.5%戊二醛的信號肽。小片開發的轉基因種子(〜1毫米3)進一步如前所述處理。通過乙醇係列脫水後,將樣品滲透並包埋在LRWhite樹脂和塊被允許進行聚合在60℃下2天。半薄切片(1微米),得到用Leica ULTRACUT UCT和甲苯胺藍染色,或用於免疫熒光研究。超薄切片(80納米)也獲得重組2G12抗體的免疫定位後,沾上醋酸鈾1%和檸檬酸鉛3%的徠卡EM AC20。光線和免疫照片拍攝用萊卡DM5500。超薄切片進行觀察用FEI TECNAIģ 2型電子顯微鏡

結果與討論

抗體2G12在玉米胚乳的沉積進行了研究。玉米胚乳細胞的特點是豐富的球形澱粉粒的存在,小球玉米醇溶蛋白體均勻塗抹在細胞質和一些蛋白質貯藏液泡(PSV)(圖1A)內。抗體鏈被如PSV船(圖1B)內的局部,如預期的,沒有進一步的定位信息進入內膜係統中的穀物種子的蛋白質。出乎意料的是,一個強的信號可還玉米蛋白體,相反的是已被報道用於表達玉米其他分泌的重組蛋白中檢測到 。

圖1:2G12抗體的玉米胚乳細胞沉積。A)光鏡,甲苯胺藍。看到玉米胚乳細胞,蛋白質貯藏液泡(箭頭)和玉米醇溶蛋白體(箭頭)蛋白質的儲物箱。B)熒光顯微鏡。強標記在蛋白貯藏液泡(箭頭)和玉米蛋白體(箭頭)內。細胞核(N),澱粉(S)。杆20微米。


在電子顯微鏡證實了這一沉積,此外,結果表明,部分玉米蛋白體已失去它們的典型球形外觀和玉米醇溶蛋白與蛋白體的正常分布(圖2)。借貸和拉金斯中描述的玉米蛋白體作為球形結構與α-和δ型玉米醇溶蛋白的低electrondense芯和一個薄的,高electrondenseγ-玉米醇溶蛋白中的周邊層。這種結構是保守的,它已被證明,所有玉米蛋白亞家族的存在下,平衡的相互作用是必要的,以穩定的玉米蛋白體並形成典型球形結構。在AG亚游集团的樣品中,該抗體的一個顯著分數隻能在還原條件下萃取,指著二硫鍵的抗體鏈和γ玉米醇溶蛋白之間形成。這種相互作用也支持的事實,即無定形的玉米蛋白體的患病率是依賴2G12的量的表達,這表明了玉米醇溶蛋白抗體低聚物的存在是負責在玉米蛋白體中觀察到的畸形的。而在重組藥物與內源性蛋白的某些情況下,相互作用期望針對口服遞送,在其他國家,像目前的情況下,它們會影響可溶性蛋白的產率。AG亚游集团建議,最小化與內源貯藏蛋白的相互作用應該是有效的策略,以提高生產玉米可溶性重組抗體。奧林巴斯顯微鏡

圖2:在WT種子(A)玉米醇溶蛋白機構和轉基因種子(B)。電鏡,一般的非特異性染色。WT玉米蛋白體(ZB)為球形,並有一個低electrondense中央核心,由一薄層高electrondensity的包圍。在轉基因種子的一些玉米蛋白體是無定形的,並顯示在周邊(ZB *)不連續electrondense層。酒0.5微米。





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