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徠卡顯微鏡通過測量熒光基團分析的離子濃度變化

2018-03-29  發布者:admin 

一個小區的許多基本功能強烈依賴於離子的精巧,但盡管如此動態餘額(例如鈣,鎂),電壓電位和細胞的胞質溶膠之間的pH值和周圍的細胞外空間。 改變這些餘額顯著改變細胞的行為和功能。 因此,在實時細胞內離子,電壓和pH動力學測量是研究人員在神經科學,細胞生物學和細胞生理學一般巨大的興趣。 在很多情況下,然而,實際的離子濃度,或在一個小區或蜂窩網絡的不同位置的相對變化的確切估計難以用常規的熒光的方法。 其原因是,這些方法沒有考慮的事實,即在一個小區的不同的部件或在蜂窩網絡中的細胞類型之間的細胞形態的差異可能影響其質量和發射的光的量的帳戶。 這可能導致大量的誤解當離子濃度,電壓或pH值的動態變化進行了研究。 比例的成像技術,通過觀察熒光團的發射波長移位或通過比較熒光團組合的發光強度,而不是單純的測量強度變化繞過這些問題。


離子濃度和pH值或電壓變化的通過測量熒光發射的變化估計

研究活動越來越注重識別和時空分布如當地的“熱點”中離子濃度,電壓或pH值在單元格或蜂窩網絡的動態變化。 這樣的“熱點”常常定位於細胞的專門的部件或在某些細胞中的蜂窩網絡中。 此外,相對於試樣中細胞代謝或結構方麵的其餘部分,這些區域通常具有不同的性質。 用於研究動態生理狀態的常規熒光在離子結合,pH值的變化或電壓變化而變化的排放強度(根據鈣結合如熒光4增加了排放)。 然而,這些標記不考慮到在結構,直徑或標記的攝取/表達的差異可以引起變化的發射光的那些不與實際的離子濃度,電壓或pH值的相關性的量。 定量和同等檢測的變化的細胞結構或不同的細胞,不敏感的方法來構造的直徑和熒光團濃度是必要的。 而相比之下,非比例成像方法,比率成像提供了機會,可重複地測量絕對細胞內離子,電壓和pH水平/改變相對於細胞直徑,熒光團濃度和成像設置的光學性質。 但是,比例成像取決於激發波長或檢測波長,強烈的光源,光學元件和快速的信號檢測的優異的變速器的快速變化。 超快濾光輪,UV光優化的物鏡,高度敏感的熒光基團和新的CCD相機的最新發展使得在高空間分辨率實惠定量高速活細胞成像。


雙波長激發/檢測是關鍵,用於測量熒光團的發射移

徠卡顯微鏡如上所述,在比率量度攝像的發光轉移僅僅強度變化,而不是被成像。為了測量發射的變化,熒光團或熒光團的組合的強度的變化,必須通過使用兩種不同的激發波長或者通過檢測在兩個不同的發射波長或者測量。 在通常使用的鈣成像染料FURA-2的情況下,該染料具有被激發的光在340nm和380nm處,檢測波長的波長為510納米。 相反的是,鈣成像染料吲-1通常是激發光在350nm的波長和檢測波長為405納米和485納米。

圖1:使用比例鈣指示劑Fura-2從鈣成像實驗的時間推移的快照。 描繪有後340納米(左)和380納米(中)的激發和相應計算出的比率的圖像(右)假彩色圖像。 所述圖像係列示出了三個個時刻:在時間的第一點(1)單元,不刺激,細胞內鈣離子是在靜息水平。 在第二時間點(2)的細胞受到刺激和鈣是在最大水平。 在時間的第三點(3)的細胞內鈣水平下降。 在該曲線圖在時間上的對應點被標記。 上部的曲線示出了340nm處的圖像的強度,中間的圖中的380nm處的圖像和下部曲線圖中,顯示了比強度。



但是,為什麽需要雙激發或發射檢測? 為什麽不能簡單地衡量變化的熒光強度?

定其中的熒光團可用於檢測改變離子的水平,電壓或pH一個實驗中,發射的熒光的光的強度取決於幾個特性。這些將在下麵的方程式所描述:

F =熒光強度; C =熒光濃度; D =直徑標本(Z軸); K =光在光通路組件的常數(單元格屬性,物鏡,過濾器等); F(x)的介紹,如果如離子綁定或出現電壓/ pH值的變化給定的熒光團的發射行為。


該方程表明,光的強度在很大程度上取決於熒光團在光路中的量。 熒光團在光路中的量取決於熒光團在細胞和樣品(D)的直徑(通過標記的攝取或表達確定的)(多個)的實際濃度(c)該被成像。 這使得它很難直接通過簡單地觀察熒光強度,例如,一個不能狀態估計一個調查離子,pH水平或電壓變化的濃度:“100強度等於遊離鈣在細胞中的100nM的”。 試樣直徑(d),熒光團的濃度(c)和檢體和設置(K)的光學特性幾乎沒有可測量的,但基本上影響整體強度檢測到。 此外,它必須牢記的是,上麵示出的公式為真,在檢體任何給定的點。隨著直徑(d)和熒光團濃度(C)不是均勻的整個一個試樣,甚至在單個細胞,對c和d的值可能是在檢體的所獲取的圖像的每一個像素的不同。 如果,例如在點“A”,在樣品中的細胞的直徑是相當高的和遊離鈣相當低,光強度可能是同一如在點“B”,它是相對的。 實驗者然而,可能錯誤地得出這樣的結論中的鈣濃度是在這兩個地方相似,因為檢測到的熒光的光強度是類似的。

圖2:草圖上麵打算說明如果在小區內如鈣濃度由一個非比例鈣敏感的熒光團所發射的光的強度來判斷可能發生的錯誤解釋。 草圖下方的曲線代表光強度的感興趣區域(ROI)中的細胞的不同部分的區域。 
在上部圖像(A)中的細胞在不同的區室像細胞突起這往往是精細結構(如樹突和神經元的軸突)不同厚度(四中表現公式)。 作為光路內的所有熒光團被激發光激發而其發射的光被收集,細胞的較厚部位出現比薄的部分更亮。 這可能導致的假設,即在細胞中的較厚部分中的鈣濃度比可比較薄部分更高,雖然實際的鈣濃度是相同的。 
在較低的草圖(B)不同的情況被示出。 在某些細胞類型的熒光團占據的細胞區室之間可能會有所不同。 在下部草圖的情況下,鈣濃度(C式中的)中的細胞的較厚部分較高,但在這方麵的熒光團濃度較低。 作為鈣敏感染料的檢測到的熒光強度不僅取決於鈣離子濃度在細胞中,而且還對熒光團濃度,人們可能會得到的印象是,在全細胞中的鈣濃度是相同的。


為了克服這些問題,並為絕對離子濃度,pH水平或電壓的精確測量,比例成像已經被開發出來。 所有比例的方法的共同之處在於發射的光的強度被測量兩次且這些強度的比(R)的計算。 取決於熒光團或所用的熒光團的組合,所述熒光團或者是激發光的兩個不同波長和發光強度的測量是在一個波長 - 或熒光團或熒光團的組合是激發光1的波長和發射的測量是在兩種不同波長的光。 這隻是意味著兩個灰度值的圖像被獲取和一比圖像從它們算出。 兩個灰度值的圖像通常有不同的強度,但在圖像中的每一個像素的強度可以通過以下所示的公式來描述:(奧林巴斯顯微鏡)

F =熒光強度; C =熒光濃度; D =直徑標本(Z軸); K =光在光通路組件的常數(單元格屬性,物鏡,過濾器等); F(x)的介紹,如果如離子綁定或出現電壓/ pH值的變化給定的熒光團的發射行為。


正如其名稱比率成像所暗示的,對於兩個同時獲得的圖像的每一個像素的比率值被計算。 例如,如果非常常用的鈣敏感染料的Fura-2(激發在340和380納米)時,所得到的方程是:

根據簡單的數學,C,D和K可以被取消,其比例是可以描述為:


虛擬比例圖像從兩個灰度值圖像計算

在實踐中,該比例是由一個計算機在一個時間推移實驗計算,在許多情況下,聯機。 通過計算相應的兩個獨立采集灰度值圖像的像素的灰度值的比率,該比率圖像被創建。 請記住,灰度值的圖像基本上都是灰度值與相機分辨率的大小或感興趣區域(ROI)的區域矩陣(512×512平時,最多不超過1000×1000像素)。 在一個鈣成像時間推移實驗與染料的Fura-2(激發:340納米和380納米,發射:510納米)這會工作如下(假設該圖像具有尺寸3×3個像素):

圖3:強度讀數值的簡化插圖CCD照相機可能使用鈣探針呋喃-2傳遞到計算機中的鈣成像實驗這一點。 在這種情況下,圖像將是3×3像素的大小。上部三個矩陣代表在鈣濃度靜止強度讀數值在340 nm和380 nm激發加上相應的比率值。照片下三個矩陣代表在高亮像素時鈣的升高的強度值的變化。 在340nm處激發的增加值,而在380nm處激發減小的值。 但是,相對的比例值也將增加。


執行用於每個圖像對中一個時間推移實驗的每個像素這個操作,產生比圖像棧。 最後,以假色圖可以應用到比圖像棧和堆然後可以觀看並定量像正常灰度值的時間推移的電影。


除了上麵提到的優點,一個比率計算具有附加的優點。 在進行活細胞成像與離子,電壓或pH敏感的熒光,熒光強度在相應波長的微小變化經常發生。 在比成像,但是,強度的增加,在一個波長和強度降低,在其它波長是在大多數情況下,觀察到的(不管探針是否被激勵或具有兩個波長檢測)。 如果這兩個獲得的圖像的比率隨後計算,基線和信號振幅之間的差將相比於熒光團的單純的強度變化被增強。 因此,比成像放大檢測到的信號的幅度。 這是用於FRET測定法特別感興趣,在那裏的受體蛋白質的下降的熒光強度和能量傳輸期間的受體蛋白的增加的熒光強度。



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