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徠卡顯微鏡TIRF在生命科學研究中的應用

2018-03-29  發布者:admin 

TIRF顯微鏡的特殊特征是倏逝場的熒光激發就業。標準視場熒光照明與程序不同與弧燈、 發光二極管或激光器,倏逝場隻有大約 100nm開始從蓋玻片/介質界麵滲透標本。這允許"加法"光學切片的標本,起價在非常高的軸向分辨率,蓋玻片,並為特定的應用程序帶來幾個優點。


TIRF顯微鏡技術優勢

TIRF 顯微鏡的一大優勢是其優秀的信號噪聲比。由於低滲透深度的倏逝場,焦點出熒光減到最小,因此幾乎沒有任何背景熒光發生。因為隻有部分單元格暴露在電磁的倏逝波的能量,生產的有害的氧,因此細胞的光毒性應力大大降低以及。這極大地提高細胞活力,並允許更長的試驗時間。此外,水平較低的光漂白隻發生在一個小區域的單元格。正從胞漿進入這一地區的新熒光穩定流量,信號噪聲比保持不變的一長段時間。此外,熒光適合 TIRF顯微鏡 (例如 EGFP,熒光 4 等) 的範圍較大,僅限於由可用激光線,以便活細胞成像技術,如煩惱、 FRAP、 鈣成像等都很容易執行。光敏感攝像機的連接使高速圖像采集的觀察快速事件。此外,TIRF 顯微鏡可以結合其他微觀的技術,如免疫熒光顯微鏡和明視場對比方法。TIRF 顯微鏡的一個缺點是到目前為止隻貼壁細胞可用於實驗,為扇區,例如,並非一般靠近倏逝波穿透試樣的蓋玻片/介質界麵。

TIRF顯微鏡在生命科學研究中

通過采用的熒光激發倏逝場空間受限,TIRF顯微鏡允許觀察定位及分子和附近等離子膜光學切片過程動力學 (通常大約 100 nm)。這是便於處理進程處於或接近細胞質膜的許多應用程序。

TIRF顯微鏡是一種優秀技術結合現場樣品中或甚至在體外與空間信息的動力學研究。它經常用於調查分子******它如發生在細胞骨架程序集。快速圖像采集和傑出的背景消除在 TIRF 顯微鏡提供精湛的觀測動態事件像質膜蛋白的招聘條件。因此,動力蛋白/驅動蛋白介導轉運的動力學可以追究,舉個例子。它也是能夠跟蹤整個的細胞器,如線粒體利用 TIRF顯微鏡。在細胞間相互作用進行調查,像細胞粘著的特殊結構很容易可以被可視化與 TIRF 顯微鏡觀察例如招募到粘著斑骨架零件。

無與倫比的信號噪聲比和 z 決議的 TIRF 顯微鏡相結合 (例如形心跟蹤方法) 的數學模型,由subdiffraction 有限公司定位的單分子是可以實現的精度為 1 nm。這是視圖的樣品的可能的如由倏逝波的熒光激發產生低背景熒光從焦點出熒光,導致低信號-到-信噪比 (如乘以字段的區域中的倏逝波的穿透深度) 定義卷中。在傳統的基於 lamp 的熒光係統將興奮並同時所有熒光束路徑中的,然後將其檢測到沒有任何有關他們的 z位置的信息。(奧林巴斯顯微鏡)

換句話說: 三個三維空間分布的熒光顯示在隻有兩個維度,如不同的 z 平麵的單元格顯示為一個平麵中獲取的圖像。這將導致在堆焊熒光在圖像中,往往使得單個熒光斑點的歧視是不可能。在 TIRF 顯微鏡,隻有大約 100 nm深倏逝波內熒光相對較小數目然而,被激動,提供樣品光學 z 段。

TIRF 圖像在 x 和 y 方向的熒光斑點的空間距離是相對較低的因為從其他 z 平麵熒光發射的光不疊加的檢測到的信號。然後應用數學模型 (例如形心跟蹤方法) 來計算檢測到的熒光分子的重心,subdiffraction 有限公司定位的單分子是否可行且精度為 1 nm。

 

圖 1: 視場圖像的微管蛋白表達 YFP                                                圖 2: YFP,微管蛋白 TIRF 圖像侵徹深度: 120 毫米


  

圖 3: YFP,微管蛋白 TIRF 圖像侵徹深度: 90 毫米                                    圖 4: YFP,微管蛋白 TIRF 圖像侵徹深度: 70 毫米


另一大 TIRF 顯微鏡領域是應用的如囊泡膜融合過程的考試。倏逝波隻激發熒光靠近細胞膜,正,可能要監視吞囊泡的形成和分泌囊泡與質膜的融合。為此目的,可以通過標記胞貨物蛋白質的熒光蛋白質,像綠色熒光蛋白標記囊泡。

由於光學切片,它有可能以解釋熒光強度作為熒光標記囊泡運動進入或離開倏逝場或作為貨物釋放或吸收的變化。在強度相當緩慢的增益將意味著運動到倏逝場,因而對細胞膜的議案。後的分泌囊泡與細胞膜融合,熒光信號迅速減小,當貨物被釋放到細胞外空間。反之亦然,可以通過使用熒光底物觀測細胞內吞作用喜歡標記的葡聚糖,被吞過程中的單元格。

另一個重要的過程發生在細胞膜是細胞信號(如信號的 G 蛋白偶聯受體)。這裏如招聘或運動中信號級聯放大的單分子 (例如 G 蛋白) 是可以觀察的。

 

圖 5: 視場圖像的 Galectin3 表達 YFP                                  圖 6: TIRF 形象的 Galectin3 YFP


所有圖像: 禮貌的教授、 博士 R.雅各、 大學馬爾堡、 臨床生物學部和細胞病理學,馬爾堡,德國





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