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徠卡顯微鏡共聚焦和數字光片影像

2018-03-28  發布者:admin 

光學成像儀器可以放大微小物體,放大遙遠恒星和揭示細節,看不見的肉眼。但出了名的患有一種惱人的問題:場深度有限。AG亚游集团的眼睛鏡頭(光學成像儀)具有相同的麻煩,但AG亚游集团的大腦巧妙地刪除所有未處於焦點的信息之前,該信號到達意識的認知。 如果圖像被保留在一張照片這是行不通的。 通過優化參數,AG亚游集团可以增加景深,但AG亚游集团通常失去的分辨率,並在z位置的信息。

如果有可能僅記錄特征在聚焦和測量相對z-位置,就可以解決的焦點問題的深度:在記錄棧的圖像,AG亚游集团就可以重建整個樣品沒有模糊的部分和在量化對象所有三個方麵。

圖1:在一個真正的共聚焦掃描顯微鏡的光路的示意圖圖。激發光(藍色)被耦合到所述顯微鏡通過分離器,用於入射照明和聚焦成衍射限製光點由物鏡1.排放經過分離器,並通過針孔空間濾波。掃描在x和y方向上的光點產生圖像,該光學部分。


1.垂直方式 - 共聚焦

最常見的是,AG亚游集团有共聚焦顯微鏡記參照光學切片時。共聚焦原理是無縫集成到標準型光學顯微鏡(雖然技術集成需要相當多的修改)。不同於普通的光學顯微鏡,真正的共聚焦成像需要一個單點的微小盡可能的照明。光點的直徑由波動光學統治並達到衍射極限的最小在d≈λ/ NA。詳細的強度分布由點擴散函數來描述。同時,檢測器還必須檢測一個點的小細越好。作為光路徑是對稱的,同樣的數學應用到一個點狀探測器的感測分布。點檢測器是通過引入一個針孔孔徑成中間像平麵中檢測路徑來實現。 在樣本中,照明和檢測的焦點必須一致 - 因此“共聚焦”顯微鏡。如圖1所示,該針孔的作用是光學除去不從焦平麵所有源自射線。它的功能是,一個空間濾波器在z方向的。

作為光學刀僅適用於在一個時間的單個點,該點必須移動從上到下線以生成圖像。強度被同步轉換成數字信息,並存儲在計算機上的幀存儲器。從該電子存儲器,該圖像被顯示的普通顯示器上。作為圖像必須由點來構造順序點,高幀速率是唯一可能的下影響的幀格式和所接受的信噪比有一定的限製。高度透明的光束路徑,例如徠卡SP檢測器,並且非常有效的傳感器,如混合探測器(HyDs)有助於提高高幀速率的性能。同時,線頻率高達12,000赫茲共聚焦顯微鏡實現,相較於CA 15000赫茲線頻率在PAL標準的電視。在適當條件下,幀速率高達約每秒500是可能的。然而,為了獲得足夠高的信號 - 噪聲圖像,幀速率將通常不超過每秒約10幀。奧林巴斯顯微鏡

涉及到掃描過程的另一個問題是上方和下方的焦平麵樣品的區域被暴露於不向圖像高量的照明能量的,但可能會導致熒光的光物理降解。作為熒光染料吸收光也高於焦平麵,熒光強度越來越暗深聚焦到樣品時。這可以補償對由自動增益調整的手段,但在信號與噪聲的成本。

真共聚焦成像的積極方麵是高分辨率(高NA透鏡容易應用),但事實上,該圖像是在焦平麵固有均勻和標準製劑以共聚焦顯微鏡容易且毫不費力地進行分析。共聚焦顯微鏡是基於標準的同軸光顯微鏡,和所有標準的顯微鏡方法和對比度模式可訪問的顯微鏡由一個簡單的開關。 它也是其它類型的掃描顯微鏡的基礎上,像多光子激發,高次諧波產生顯微鏡,相幹反斯托克斯拉曼散射顯微鏡和超分辨率技術STED(受激發射損耗顯微鏡)。


2.水平方向 - 光板

雖然共聚焦顯微鏡是黃金標準光學切片,第一顯微鏡來執行此任務前出台了半個世紀。該“的Spalt-Ultramikroskop”采用了明亮的光源(弧光燈或太陽),它集中成一個狹縫孔。第二透鏡,通常是一個重複使用的物鏡,投射該縫隙入試樣正交於顯微鏡的光軸。這種設計有效地創造了一些2微米厚度的片材狀照明。原來的應用程序所關心的次分辨率顆粒,像彩色玻璃分散黃金。然後,它證明了各種膠體樣品和混濁介質的,這是在化學和醫學研究中常用分析是有用的。這種早期光片顯微鏡僅限於向下形象化的微小粒子,以5納米,這會導致可觀察到如在顯微鏡的垂直光束路徑中的衍射圖案的照明的球形散射。 其結果是,它可視不可分辨的顆粒,被稱為“Ultramikronen”,這是“超越顯微鏡的分辨率”。命名為“超分辨率顯微鏡”建議設計的超分辨型擺在首位,但它變得平坦了作者的超顯微鏡顯然受到光學衍射。


圖2:在的Spalt,Ultramikroskop光路示意圖圖。激發光被正交聚焦物鏡1通過狹縫(的Spalt)進入樣品。發射由物鏡2收集,並且可以通過照相機作為光學部分被記錄。


後來,設計被開發了規避了精度狹縫和采用桶透鏡來創建光的片材在垂直於光軸。這種布置然後用熒光,固定的樣品。光片顯微鏡證明對厚的樣品的快速實時成像特別有利的,作為漂白不太明顯和圖像記錄並行地執行由數碼相機共聚焦和數字光片影像如圖赫伊斯肯。在z方向上的吸收是不是一個問題,因為該照明等於在Z中在其上的顯微鏡被聚焦的所有位置。但是,發射光必須通過樣品象在一個普通的顯微鏡,這可能會惡化圖像以厚的樣品在一定程度上。盡管如此,有在橫向方向上的陰影效應:光被第一吸附在那裏的照明光入射到樣品的一側,因此熒光變暗的相反側。Vo1E時對於這種效應的補償,通過轉動樣品和從不同方位收集圖像。Dodt照射從兩個相對側的樣品,以補償光片的吸收。代替使用投射狹縫孔或圓柱透鏡,凱勒掃描一個薄的激光束在垂直於觀察軸線。這項計劃被稱為“數碼掃描光片”。

圖3:一個相幹融合為真共聚焦掃描和垂直方向轉動的數字光片掃描光路的原理圖圖。有關細節請參見圖例圖1和2。這種配置允許光學切片的兩種模式之間無縫切換。


3.結合

兩種範例已在生物醫學研究和常規被引入,服務於許多新的見解和生物的概念和疾病的理解,和細胞組分的結構和功能的影響。 在儀器方麵,兩種方法都顯著不同,正交照明被視為係統的一個獨立部分,並結合一個同軸顯微鏡以執行任務。共聚焦顯微鏡使用光束掃描係統來創建二維圖像,數字掃描光片采用波束掃描創建行區域。這立即引起了它是否可能以兩種策略組合在一個單一的係統的問題。徠卡引入了新的Leica TCS SP8中的DLS光片顯微鏡這樣的組合。

徠卡TCS SP8 DLS是基於普通共聚焦顯微鏡,通過借助於一檢測針孔的空間濾波離焦的光進行光學切片同軸掃描裝置。通過該移動,在兩個橫向方向上的照射點振鏡掃描鏡裝置產生的圖像。為了將這些係統成數字光片顯微鏡,必須使照明光束垂直於光軸穿過樣品。 通過引入小的鏡子在焦平麵的位置,就在觀察視野,所需的正交照明實現。這樣的偏轉反射鏡被機械地連接到觀察透鏡,以確保被照射的z位置總是在圖像生成光學元件的焦點,而圖像投影到攝像機的強度轉換成數字圖像。

照明光束的單個位置不會引起二維圖像,但隻有一行。一個可利用的橫向掃描方式的共聚焦點顯微鏡固有實現掃描在垂直方向上的照明線,得到所需的兩維平麵中的一個。

如果第二反射鏡的相反側引入,有可能通過同一透鏡照亮從兩側的樣品-僅通過使用共聚焦顯微鏡的光束掃描裝置的第二軸線。這滿足了需要補償的吸收引起的陰影。最終的圖像,然後再次構成從兩個圖像具有不同的照明方向。

成像在共聚焦模式下,在z驅動機構具有被定位以使照明光束的焦點與特征是將被成像重合。掃描過程然後覆蓋視場,這是操作一個共聚焦顯微鏡的常見方式的正好內側。要切換到光片采集,聚焦具有由反射鏡的左右到光軸的距離上移動。在這種情況下,照明光束的平麵產生部分將落入觀測場的中心。掃描裝置需要指向視場的邊緣,以打到鏡。

這種結合不僅降低成本的儀器,作為兩個不同的樂器被合並成一個,但它也可以讓經典的共聚焦和數字光片顯微鏡的組合。其結果是,在同一係統允許任何血樣與是為解決目前的研究問題最合適的技術進行研究。它還使各種新應用機會由於共聚焦路徑可用於光操作與的誘導的作用隨後平緩光片成像。




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