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新聞資訊

奧林巴斯顯微鏡腦組織浮動冷凍切片間接的單、雙和三的免疫熒光

2018-03-28  發布者:admin 

間接(兩階段)免疫是一個功能強大的成像技術,使得能夠高度特異性靶使用主(直接)和次級(間接)抗體的組合的可視化。 腦組織中的興趣抗原決定首先用從公共主機隨後定向到主機初級和綴合的合成的二級抗體是單克隆或多克隆第一抗體(小鼠,兔,雞,鼠,驢等)或自然熒光。 間通常標記為在腦組織切片的抗體目標是膠質纖維酸性蛋白(GFAP),神經元和軸突神經絲(既磷酸化和非磷酸化;重,中,和光),第三類的β微管蛋白,微管相關蛋白,血 - 腦屏障的蛋白,突觸蛋白,髓鞘,和主機與特定疾病相關的抗原。

間為在腦組織中的抗原的可視化的有用的熒光染料是羅丹明,熒光素,所述的Alexa Fluor係列,和花青染料。 複染使用各種流行的DNA結合染料的細胞核如下與二級抗體治療。 該協議細節一個通用方法在厚度染色30和50微米之間的冷凍腦浮冷凍切片。

顯示在圖1是一個共聚焦圖像揭示神經膠質纖維酸性蛋白和神經細絲重的複雜網絡結構,鼠腦海馬區(冠狀麵)的厚(30微米)部分。 的部分進行染色如下詳述使用雞抗NF-H和兔抗GFAP的一抗的雞尾酒,隨後山羊抗雞和抗 - 兔二級抗體綴合到合成熒光團的Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 568,分別。 細胞核進行複用DRAQ5。 使用488納米的氬離子激光(的Alexa Fluor 488)將試樣成像用60倍的油浸物鏡(無放大),一個543納米的氦氖激光(Alexa Fluor 568),和一個633納米氦氖激光(DRAQ5;偽彩色青色)。 腦切片圖像以灰度獲得並隨後偽彩色與色調近似的各探針的熒光發射光譜,除如上所述。

試劑

  • Dulbecco氏磷酸鹽緩衝鹽水(PBSA) -溶解的0.2g氯化鉀,0.2克磷酸二氫鉀,8.0克氯化鈉,1.74克磷酸氫二鈉(七水合物)的一升雙蒸水。 將pH調節至7.2,用濃氫氧化鈉。

  • 磷酸鹽緩衝鹽水與鈣和鎂(PBS) -溶解的0.2g氯化鉀,0.2克磷酸二氫鉀,8.0克氯化鈉,1.74克磷酸氫二鈉(七水合物)的一升雙蒸水。 溶解這些試劑後,加入0.132克的氯化鈣二水合物和0.10克氯化鎂六水合物。 將pH調節至7.2,用濃氫氧化鈉。 此外,二價堿土金屬的緩衝溶液是有用的,以確保未冷凝染色質保持不變,染色過程中的核內包含的,使用通過紫外線照射(DAPI和Hoechst公司)激發DNA探針時大大降低背景熒光水平。

  • 固色劑 -溶解在溫和加熱百毫升PBSA 3.7克多聚甲醛(準備新鮮的定影液每天)。 冷卻後,過濾該溶液。

  • 透緩衝器 - 0.2%的Triton X-100的PBS(聲處理洗滌劑緩衝器30分鍾,以在使用前立即一小時)。

  • 阻斷緩衝液 -在PBS中的10%正常山羊血清(NGS)含0.05%的曲拉通X-100(加2-3毫克疊氮化鈉的每100毫升封閉緩衝液,以消除微生物的生長)。 如果正在使用的第二抗體的宿主比山羊等,製備封閉緩衝液與來自該物種的正常血清。奧林巴斯顯微鏡

  • PBS洗滌緩衝液 -使用PBS緩衝液固定後,透化之前和與初級和二級抗體探針之前立即除了那些需要專門緩衝器核染料是不用PBS兼容組織核染色後處理。

  • PBS-海衛洗滌液 -對於洗序列立即通透後抗體治療後(核染料染色前),用PBS含0.05%的的Triton X-100。

  • PBS-的Triton洗滌緩衝液與阻斷血清 -對於洗滌序列的初級和二級抗體孵育之間和二次抗體處理後,立即用PBS中0.05%的曲拉通X-100和1%的正常宿主(山羊)血清。

  • 初級抗體混合物 -加入濃縮的初級抗體原液適當體積,以封閉緩衝液稀釋的50%的用PBS-的Triton洗滌緩衝液(從而得到最後的濃度為5%的正常山羊血清)。 從不同的主機幾個初級抗體可混入雞尾酒。 組織薄片收到250-500微升抗體溶液。

  • 次級抗體/鬼筆環肽雞尾酒 -添加綴合到所選擇的熒光第二抗體的適當體積(例如,8微升的山羊抗小鼠重鏈和輕鏈的次級IgG抗體的Alexa Fluor 350在2毫克每毫升)和20-30微升鬼筆環肽原液(6.6微摩爾)至1毫升封閉緩衝液稀釋50%的用PBS-的Triton洗滌緩衝液的(從而得到最後的濃度為5%的正常山羊或其他宿主血清)。 在許多情況下,phallotoxin肌動蛋白探針可以被與來自其它物種(匹配於初級抗體)的一個或多個附加的第二抗體。 作為與第一抗體混合物,組織薄切片接收250-500微升的二級抗體溶液。

  • 核染料 -染色準備核染料新鮮稀釋之前立即。 當使用SYTOX,DRAQ5和花青核汙漬,背景熒光可顯著(特別是在細胞質中)加入10毫克RNA酶的封閉緩衝液減少。 在這種情況下,塊的細胞或組織,在37攝氏度左右,而不是在室溫下,以活化該酶。

  • 核染料洗滌緩衝液 -赫斯特和SYTOX染料需要Hanks平衡鹽溶液( 漢克斯BSS),而DAPI,以及單體和二聚體花青核汙漬,可以用PBS使用。

核染液稀釋

  • 赫斯特(33342和33258) -稀釋5微升的10毫克/毫升儲液在150毫升漢克斯BSS的(治療30分鍾)。

  • SYTOX綠和橙色 -稀釋10微升的在250毫升漢克斯BSS的(治療,30分鍾)濃縮的儲備溶液(5毫摩爾的二甲亞碸)。

  • DAPI -稀釋5微升的10毫克/毫升儲液在150毫升PBS中稀釋50%的用雙蒸水(處理5分鍾)。

  • 單體和二聚體菁染料 -稀釋濃縮的儲備溶液(例如,TO-PRO-3;通常為1毫摩爾),為製造商推薦的(1:20至1:100)的PBS(處理5〜30分鍾)。

  • DRAQ5 -稀釋濃縮的儲備溶液(通常為1毫摩爾),為製造商推薦的(1:20至1:100)的PBS(處理5〜30分鍾)。

步驟

傳輸的一個或多個冷凍(攝氏-80度)的浮動冰凍切片到6孔培養皿中,在冷凍室的溫度並置於幹冰上運輸。輕輕加入2毫升的PBS緩衝液中,以每孔含有一個部分,以允許部分解凍並漂浮在緩衝器中。 緩慢將培養皿至室溫,旋轉組織切片,因為他們正在水合定軌振蕩器上以每分鍾5-10轉。

注意:不要讓部分,以加入PBS緩衝之前溫至室溫。 小心吸說明遠離浮動部分用巴氏吸管和擠壓球(不使用真空吸氣器)的所有解決方案。

浮動切片固定除去從該動物前,但也可以再次補液後使用多聚甲醛處理30分鍾的固定。 這是一個可選步驟。

15分鍾(每次洗滌)洗滌每個部分4次在PBS中。 緩慢旋轉的組織切片,因為他們正在以每分鍾5-10轉洗滌在定軌振蕩器。

溶解在組織切片用透化緩衝液的膜進行處理兩小時。 緩慢旋轉的組織切片,因為他們正在透定軌振蕩器上以每分鍾5-10轉。

阻斷非特異性的二級抗體和合成的熒光團結合位點的封閉緩衝液在37攝氏度2-4小時。

封閉後,小心添加第一抗體雞尾酒(每個培養腔室孔1毫升)不幹擾的組織切片。 孵育覆蓋培養板中,在冰箱中(4攝氏度)進行48小時的聚乙烯袋中。 這是沒有必要覆蓋培養室用鋁箔(避光)在這一點上,因為熒光團不存在。

浮動部分染色室配置

在加入第一抗體後的第二天,用PBS-的Triton洗滌緩衝液含1%的阻斷血清洗浮動部分的四倍(20分鍾每次洗滌)。 緩慢旋轉的組織切片,因為他們正在以每分鍾5-10轉洗滌在定軌振蕩器。

清洗順序後,小心添加輔助抗體混合物(每文化室以及1毫升)不幹擾組織切片。 孵育覆蓋培養板中,在冰箱中(4攝氏度)進行48小時的聚乙烯袋中。 通過將鋁箔的片材在培養室避光。

上與第二抗體處理後的第二天,用PBS-的Triton洗滌緩衝液含1%的阻斷血清洗浮動部分的四倍(20分鍾每次洗滌)。 覆蓋培養室用鋁箔(以保護光),緩慢旋轉的組織切片,因為他們正在以每分鍾5-10轉洗滌在定軌振蕩器。

通過洗滌該組織切片用PBS為兩個或三個緩衝液交換(每次15分鍾洗滌)完全除去阻斷血清的洗滌緩衝液。

對於DAPI和花青核counterstains,在PBS中以及添加的稀釋染料到培養腔室和處理的樣品中推薦的時間:5-10分鍾DAPI; 15-30分鍾花青染料(從光用鋁箔保護)。 當使用的Hoechst或SYTOX汙漬(孵育30分鍾)時,首先要複染洗在Hanks平衡鹽溶液的載玻片兩個緩衝交換之前。

用PBS或Hanks平衡鹽溶液(取決於核染料)三次在15分鍾時,每次洗滌洗counterstained標本。 保護從光用鋁箔。

最後洗滌步驟後,將一個22×22毫米(或22×50毫米,這取決於截麵尺寸)蓋玻片下的每個部分,並仔細吸出緩衝用吸管,同時定位部分下的玻璃,使其附著中心的蓋玻片。 經過緩衝已被完全刪除,拉蓋玻片從井鉗的幫助。 放置蓋玻片放在一個平麵上,加一滴安裝介質,放在部分清潔的顯微鏡載玻片和轉動滑動用蓋玻片上下倒置。 離開載玻片在室溫下至少1-2小時以幹燥該部分。




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