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新聞資訊

徠卡顯微鏡激光顯微切割係統和Qiagen公司試劑盒成功分析RNA

2018-03-28  發布者:admin 

激光顯微切割(LMD)允許分離單個細胞或染色體,是一個完善的技術通過PCR或測序技術的核酸含量樣品製備之前下遊分析。在這裏,AG亚游集团描述甚至很少量的徠卡LMD係統和Qiagen公司試劑盒核酸純化的成功結合。所呈現的工作流程和協議提供成功的LMD應用的基礎,而不的核酸量和剩餘的RNA的完整性的過程強調產品的高品質中的任何損失。

材料 - 實驗室庫存

徠卡LMD係統

圖1


  • 低溫恒溫器(如徠卡CM1850 UV)

  • 吸取10-1,000微升

  • 吸取2-20微升

  • 離心管

  • 鑷子和刷低溫恒溫器


材料 - 化學品和消耗品

Qiagen公司的RNeasy微型試劑盒

圖2

  • 一袋50毫升獵鷹管

  • 純乙醇(乙醇),分子生物學級

  • 分子生物學級水

  • 甲酚紫

  • 鋁箔

  • 0.50.2毫升薄壁PCR管平駕駛室適合LMD階段收集架

  • 槍頭(1 mL固移液管和20微升吸管)

  • 注射用無菌過濾嘴

  • 刀片cryotome

  • 封口膜

  • 徠卡LMD載玻片(如4微米PEN幀)

  • 矽膠袋

  • Kimwipes


上遊的準備

1%甲酚紫(CV)在100%的乙醇(EtOH)溶液:添加5毫克甲酚紫粉到50ml Falcon試管中,加入100%乙醇以填充50毫升 應準備前1周使用。但在獵鷹冰箱,用鋁箔覆蓋(甲酚紫對光敏感),搖勻每天平緩。奧林巴斯顯微鏡

用於固定乙醇行洗滌步驟:

  • 2次75%乙醇:填寫37.5毫升乙醇到50ml獵鷹管,並添加分子生物學級水至50ml

  • 將一個75%的乙醇獵鷹到-20℃的冰櫃

  • 95%乙醇47.5毫升乙醇到50ml獵鷹管,並添加分子生物學級水至50ml

  • 100%的乙醇50毫升EtOH中入50ml Falcon管中

  • 乙醇排在Falcon管可(重新)使用長達3天。

重要提示:

  • 獵鷹印章用封口膜儲存→這將避免乙醇蒸發距離!

  • 放置LMD載玻片10分鍾下的UV-C光→acivate膜更好部粘附和消毒的表麵!

  • 將0.2或0.5 mL管蓋下的UV-C光至少開放30分鍾→消毒和消除任何RNA核糖核酸酶和!

  • 準備三五十毫升獵鷹管與一些矽膠袋圓錐→二氧化矽將保持載玻片和部分幹燥,RNA工作意味著濕度和水分是你的敵人,因為那些能激活RNA酶!

Cryosectioning

與Cryosample地方塊分成徠卡低溫恒溫器直接從-80℃,並讓它平衡至少30分鍾,在-19℃。

在圖徠卡CM1850紫外線cryotome在-19℃的準備削減3:組織塊。


平衡後製成適當厚度的部分(厚度應選擇所關注的細胞的根據直徑,此測試10μm的切片製備的)。

將一個(卷曲)直接從部分到低溫0.5毫升管,立即加入350微升RLT緩衝液(Qiagen公司微RNeasy試劑盒的內容)。 這將作為陽性對照的質量和數量。

 

圖4:用冷水鑷子收集卷曲部分直接進入無菌管帽。350微升RLT緩衝立即加入到保護RNA降解。


   

圖5:部分準備和安裝在PEN幀載玻片。將冷凍的部分將容易熔化到它來自室溫膜上。


把與部分進獵鷹用75%EtOH溶液的滑動,在-20℃下進行2分鍾(簡短固定)。2分鍾後短暫風幹的載玻片,並將其存儲在50毫升獵鷹與圓錐一些矽膠袋(保持幹燥)。

重複此與另一部分和滑動安裝,但不是存儲通過無菌過濾嘴中添加與所述注射器1%甲酚紫溶液幾滴。讓關於段1分鍾的染色溶液。事後經浸漬滑洗甲酚紫的簡要到75%的乙醇,再用95%的乙醇,最後100%的乙醇。 簡言之空氣幹燥的載玻片,並將其存儲在50毫升獵鷹與圓錐一些矽膠袋(保持幹燥)。

與另一部分和載玻片重複整個過程。

 

圖6:甲酚紫是通過無菌過濾器覆蓋載玻片上的部分為1分鍾施加一個注射器。


  

圖7:染色後的洗滌步驟:在滑動浸入升乙醇行以洗掉殘留甲酚紫。

重要提示:

  • 在獵鷹管與圓錐一些矽膠袋商店載玻片和密封的用封口膜→二氧化矽將保持載玻片和部分幹燥,密封防止水分環境!


存儲所有管和獵鷹與冰滑梯。 讓載玻片平衡15分鍾,在室溫下旁LMD係統在密封隼先前使用。


LMD測試滑梯

你現在應該有:

  • 在管1部分與350微升的RLT緩衝液(陽性對照)

  • 1部安裝在滑動和固定用EtOH存儲在50ml隼與二氧化矽袋

  • 2載玻片安裝固定部分與乙醇,並用CV,存儲在50毫升獵鷹用矽膠袋

圖8:緩衝器,管,載玻片獵鷹和75%的乙醇從在冰上冷凍。


與未染色部分中的滑動被用作另一個控製。 因此,從直接與RLT緩衝膜消化它,並將其轉移到0.5毫升管(RLT緩衝總量必須是350微升,消化從載玻片不要使用這一切,因為它會衝洗掉載玻片!)。

一個固定的和染色的載玻片被用作另一個控製。 因此,直接從帶RLT緩衝膜消化的部分,並將其轉移到0.5毫升管(RLT緩衝的總量必須是350微升,不從滑動使用所有它進行消化,因為它會衝洗掉滑動!) 。


徠卡LMD7000用於RNA分析

剩餘的固定和染色的載玻片被應用於LMD。因此加載在樣品架滑動並加載0.5毫升管中的收集架。 選擇負載的收集器的位置和使用所希望的倍率標記解剖全部與LMD軟件。啟動所有的部分被收集到收集管解剖後的激光和控製。 在需要的情況下重新切割部分使用移動+切割,以確保所有收集。

卸載收集管,小心蓋上蓋子,並簡要降速dissectates。打開蓋子,並添加350微升的RLT緩衝液(高達65微升的RLT緩衝液可以添加到集合帽切割前)。

 

圖9:PEN框架具有固定和染色的切片上被裝載到LMD係統。


裝入另一收集罩和剖析空膜接近。其中,部分被收集的區域(大致平方微米麵積相同的大小)。 卸載收集管,小心蓋上蓋子,並簡要降速dissectates。 打開蓋子,並添加350微升的RLT緩衝液(高達65微升的RLT緩衝液可以添加到集合帽切割前)。 該管將作為LMD陰性對照以後。

圖10:節解剖一塊一塊的選擇放大倍率到無菌管蓋。


  

圖11:標記區和解剖結果很容易顯現:左切割線,中部,麵積解剖,右dissectate在收集管帽。

重要提示:

  • 多達65微升的RLT緩衝液可直接應用到收集管帽捕獲後直接以保護dissectate的內容從降解

圖12:用低倍收集Dissectates是用肉眼可看見的(使用5倍的目標實現的例子dissectates的)。


製備及加工下遊激光顯微切割

  • 添加44毫升瓶子與RPE和檢查乙醇添加的複選框。

  • 製備70%EtOH中的溶液中添加35毫升100%乙醇至50ml隼和添加15毫升分子生物學級水。

  • 製備80%EtOH中的溶液中添加40毫升100%乙醇至50ml隼和加入10 mL分子生物學級水。

圖13:使用Qiagen公司的RNeasy RNA提取輕微的修改協議®微試劑盒使用。


利用RNA Qiagen公司微套件具有以下略作修改協議的摘錄:

  1. 都準備好管。

  1. 加入350微升70%乙醇,每管(在案件移送到合適音量另一管加入350微升70%乙醇前),仔細拌入吸管,直接轉移到紅離心柱。

重要提示:

350微升應分別為100和250μl到不超過0.5毫升管的體積。 混合可以直接在柱來完成。

  1. 旋轉15秒,以10000rpm。

圖14:緩衝液被施加到Qiagen公司的RNeasy®旋轉柱。


  1. 丟棄通過流並添加350微升RW1洗柱

  2. 旋轉15秒,以10000rpm。

圖15:列在離心機蓄勢待發。


  1. 丟棄通過流量,列放置到新的2ml管中,並加入500μl的RPE(EtOH中加入之前)洗柱

  2. 旋轉15秒,以10000rpm。

  3. 丟棄通過流動,加入500微升80%的乙醇洗柱

  4. 旋轉2分鍾,在13,000rpm下

  5. 丟棄流過和列放置到新的2ml管中

  6. 旋轉5分鍾,最大。 速度和蓋子打開以幹燥塔的二氧化矽膜

  7. 洗脫在14微升水:仔細吸管14微升無RNA酶的水送入塔膜的中部和列放置到一個新鮮和標記的1.5mL管中

圖16:14微升無RNase水輕輕施加到塔的中部,用於對提取的RNA eluation。


  1. 旋轉1分鍾,在13,000rpm下

  2. 仔細吸管流過回柱膜的中間

  3. 旋轉2分鍾,在13,000rpm下

洗脫液應儲存在-80℃或如果可能的話立即用於質量和數量的評估。


快速匯總協議

示例:

A - 樣品直接從采摘冷凍(整體陽性對照) 
β - 樣品固定,用吸管挑(陽性對照,乙醇固定作用) 
ç - 樣品固定染色,用移液管(陽性對照,乙醇固定和染色的效果)挑 
ð - 樣品固定染色,由LMD(LMD的效果)收集 
Ë - 樣品采集旁邊空膜(陰性對照LMD進程/汙染物) 
F - RLT緩衝陰性對照下遊純化 

RNA與Qiagen公司微提取試劑盒:

  1. 加入350微升RLT緩衝

  2. 加入350微升70%乙醇,用吸管混合,並直接傳輸到列

  3. 旋轉15秒,10000轉

  4. 丟棄流過,並用350微升RW1

  5. 旋轉15秒,10000轉

  6. 丟棄流過,並用500微升RPE(添加乙醇之前)

  7. 旋轉15秒,10000轉

  8. 丟棄流過和洗滌用500μl80%的乙醇

  9. 旋轉2分鍾,10000轉

  10. 丟棄流經

  11. 旋轉2分鍾,最大值 速度蓋子打開幹燥膜

  12. 在洗脫14微升水*

  13. 自旋1分鍾,全速

  14. 使用洗脫液,並把它回柱

  15. 自旋1分鍾,全速

結果

圖17


RIN®

28S / 18S 
(高度)

28S / 18S 
(區)

濃。 
(納克/微升)

樣本 
描述

警報

觀察

總RNA區

rRNA基因區

A0

-

-

-

137



階梯

-

-

A1

7.4

1.4

1.9

69.1

一個



2.79

0.61

B1

7.1

1.3

1.9

84.5

B



3.41

0.76

C1

7.3

1.4

2.0

127

C



5.13

1.26

D1

7.2

1.0

2.0

83.6

D



3.38

0.78

E1

6.5

0.4

0.4

110

Ë



4.44

0.98

D9

6.9

0.7

0.9

67.3

D



2.68

0.59

C2

-

-

-

7.36

ķ

RNA濃度外推薦範圍為海相

0.30

-

D2

-

-

-

6.57

L

RNA濃度外推薦範圍為海相

0.27

-

樣品名稱

材料

日期

時間

A260濃度(ng / UL)

A260(10mm)的

A280(10mm)的

A260 / A280

A260 / A230

blank_6

RNA

2014年12月11日

0

0

0

-

-

一個

RNA

2014年12月11日

32.42

0.81

0.41

1.98

0.13

B

RNA

2014年12月11日

48.18

1.2

0.58

2.07

0.1

C

RNA

2014年12月11日

71.01

1.78

0.89

2

1.51

D

RNA

2014年12月11日

48.32

1.21

0.54

2.24

0.03

Ë

RNA

2014年12月11日

64.65

1.62

0.73

2.2

0.06

D

RNA

2014年12月10日

41.79

1.04

0.47

2.23

0.03

ķ

RNA

2014年12月11日

1.72

0.04

0.02

1.97

0.02

L

RNA

2014年12月11日

0.74

0.02

0.01

2.91

0.02


質量

所有樣品(A-D)具有不同的治療具有幾乎相同的質量(RIN 7.1-7.4)。 無影響乙醇固定,染色和徠卡LMD解剖檢測。

低溫儲存滑動的一個封口膜密封50毫升Falcon管中在-80℃下過夜,在室溫下輕輕地解凍分步進行20分鍾在-20℃冷凍,20分鍾在4℃冰箱和15分鍾之前重新打開獵鷹管導致徠卡LMD解剖後類似的結果,以及(樣品E1及D9,RIN 6.9和6.5)。

所有陰性對照空。


數量

所有樣品(A-D)與不同的治療方法幾乎相同的量,隻有樣品C(固定,染色,直接拿起從載玻片)顯示出較高的數量,然後陽性對照(樣品A)。不影響從乙醇固定,染色或徠卡LMD解剖檢測。

低溫儲存滑動的一個封口膜密封50毫升Falcon管中,在-80℃下過夜,在現有室溫輕輕解凍分步進行20分鍾在-20℃冷凍,20分鍾在4℃冰箱和15分鍾重新打開獵鷹管導致徠卡LMD解剖後類似的結果,以及(樣品E1和D9,儲存後略高的數量)。

所有陰性對照空。

測量方法不同導致的測量誤差共同不同的結果。


總之,這些數據清楚地表明,在工作流不影響RNA的質量和數量。


確認

我想感謝博士倫道夫Habecker主辦的LMD車間。




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