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徠卡顯微鏡對於共振掃描振鏡控製智能

2018-03-28  發布者:admin 

高時間分辨率激光共聚焦顯微鏡(HTRCLSM)需要快速的掃描設備。盡管非共振掃描振鏡允許完全控製的位置,但隻在速度慢,共振掃描儀能夠每秒〜25,000行,但提供更少的定位自由。仍然允許縮放和平移功能,幾種方法都試過了,用不同的成功。在TCS係列徠卡共聚焦顯微鏡使用一個非常聰明的解決方案使無級短開關時間縮放。

圖:©MNStudio - Fotolia.com


“生物學是有關生命的研究和生物的自然科學”是生物學的維基百科條目的引言句而在過去的日子顯微鏡主要關注對象死亡(雖然以前活著),生物顯微鏡的最終目的是可視化生活的對象。雖然小生物樣品經常看不活躍,微觀角度推出充滿活力的活動。細菌已經快速移動鞭毛,細胞和組織表現出的代謝物非常快的改變,囊泡運輸在顯著的速度和電信號由毫秒範圍動作電位廣播。遵循這些活動,高幀速率是必需的。在激光共聚焦顯微鏡早期的做法是引入了並行技術,例如旋轉的光盤係統,但他們缺乏真正的共聚焦切片性能。單點掃描器提供最佳的光學切片的性能,但通常被認為是慢的。采用共振振鏡掃描儀,現代技術可以在500每秒的範圍內達到的幀速率。 本文介紹了如何將這些設備的限製已被克服。


振鏡掃描儀 - 繪畫與激光

為了掃描一個光點在兩維區域時,光束的角度已被改變。 這個任務是很容易通過插入反射鏡成偏轉光束的光束路徑解決。 為了進行掃描,在反射鏡具有可旋轉。 的黃金標準旋轉鏡是采用所謂的“電流計掃描器”。 這些裝置已被廣泛用於在激光投影機,用於激光節目和電影放映。

術語“電流計”源於電計量。 以測量電流,線圈被插入一個磁場。一個針被安裝在線圈的旋轉軸線。 一旦電流流過線圈時,洛倫茲力使針的偏轉。 的電流越高,更寬抵抗複位力偏轉。 偏轉可以被校準用於測量電流。奧林巴斯顯微鏡

另一方麵:如果當前是已知的,人們可以產生所需的偏轉。對於光指向應用程序(掃描儀),針被反射鏡交換。當光束撞擊反射鏡,反射變化兩倍的旋轉角度的角度。

進行精確定位,旋轉角度由位置傳感器解碼,安裝在旋轉杆的另一側。 一個反饋係統控製的驅動電流,以確保偏轉總是恰好在所希望的角度。 這允許掃描速度和靜態定位在可用的xy平麵的所有點的控製。這些掃描儀被稱為“閉環”由於封閉反饋係統。 在成像應用中,一個重要的圖案是鋸齒掃描。 以所需的速度線掃描是通過在所要求的速度移動光點在一個方向上(“×”)線性地及時執行。 然後,重複該掃描,反射鏡被移回以最大速度的起始角度。 這個模式是可能的慢行頻來替代正弦掃描的二維掃描-標準應用-是由垂直地引入第二掃描器進光束路徑產生的。 該第二(“y”)的掃描儀產生的增量在所述第二軸線。 很顯然,在y掃描器的速度(在標準條件下)是慢得多相比於x掃描器,因此具有少得多的限製。

在約500 Hz的線頻率和512×512像素的全幀,幀速率達到約每秒一個。與固定的樣品,這是足夠的時間分辨率,並給出大信噪比。 另一方麵,成像快速移動的物體時,在100以上每秒的幀頻(優選約500每秒)是期望的。如果這些圖像是有每幀10行(“條掃描”),一個掃描儀是必要的,可以產生每秒5000線。

盡管掃描儀和掃描反射鏡是由輕質材料製成,並盡可能地小,它們是施加顯著慣性機械裝置。因此,在更高的速度,他們隻能執行正弦掃描。在極端情況下,掃描儀已經開發了僅在正弦模式和僅在其共振頻率掃描。像秋千,這些設備隻能改變其幅度(通過供給更多的能量)和它們的相位,在期間相對於外部標準的位置。目前,可供共振掃描振鏡12,000赫茲的頻率。當在記錄過程中既來回列車(雙向成像)數據,線路頻率進行成像可以達到24000,因為大多數現代運動圖片被使用對應於〜45%的第二全幀,大約相同的頻率。在黑暗的一麵,這些共振掃描儀無法控製的位置和掃描頻率。這種掃描儀提供了一個電磁竊聽反饋,但這是太不精確是任何使用。

振鏡掃描器,如在徠卡真共焦掃描儀(TCS)使用時,是檢流計已用於測量電參數,計量裝置的衍生物。最初,這些設備分別配備旋轉線圈,具有安裝在旋轉軸的指針。更先進的版本使用安裝在軸上的反射鏡和準直光,是由在屏幕上的反光鏡(飛點法)反映。這種裝置類似於一個電流計掃描器,它指向激光到由施加的電流所控製的特定方向的原理。

圖1:最初,電流計被設計用於測量電流通過的線圈,可以在磁場中旋轉的裝置。 左:當電流流過線圈時,洛倫茲力傾斜線圈和被固定到旋轉軸的針。 傾斜依賴於電流I,可以進行校準。 
右:一個更精確的版本是配備有安裝在軸代替針的反射鏡。 在閃耀準直的光(最好的情況下:激光)到鏡,偏轉可以在屏幕上被監視(飛點法)。 
當一個已知的電流被施加時,偏轉是可以控製的。 一個編程的電流列車將導致現貨的時間運動模式。 這是檢流計掃描儀的工作原理。


在場號 - 比變焦倍數是更好的選擇

顯微鏡有圓形光學。如果你往下看顯微鏡,你所看到的是一個圓。可以如何樣品的多觀察在給定的放大率由場號FN(Sehfeldzahl,SFZ),它是圖像的以mm在目鏡(中間圖像平麵)的場平麵的直徑指定。如果使用40X鏡頭,並與現場25號目鏡,那麽你可以觀察的實際麵積是直徑為625微米的圓形。當然,透鏡必須被充分地校正,以處理這樣的大場,如果體麵成像是目標,並且通常該領域被限製為共焦掃描,以確保足夠的圖像質量。掃描圖像是典型的正方形或長方形。如果掃描指定了一個完整的字段(例如上述的SFZ 25),則對角線的矩形等於場號,和40倍透鏡將使625微米的對角線。如果掃描一個正方形,邊對應於442微米×442微米。

代替掃描滿場的,這是非常簡單的隻通過減小電流計掃描器的振幅(伸長)掃描,隻有一小部分。如果掃描幅度的一半,隻有一半的各尺寸的記錄。 正方形的區域,然後對應於一季度滿場掃描。

盡管如此,像素的數量是相同的,而當一個監視器上顯示,該顯示器的尺寸沒有任何改變,當然。在本質上,較小的掃描已經產生由兩個因素的附加放大率。 這種額外的放大倍數是無級可調,並呼籲“掃描縮放”。它不是由光學元件獲得的,因此不應混在一起的光學變焦的安排。 因為它不是在顯示記錄的象素數據的變型,它不應該被混在一起顯示縮放選項,無論是。實際上,掃描變焦是機械放大由掃描裝置的機械性能(盡管這是電驅動且電子和計算機化控製)來控製。

由於沒有限製減少掃描幅度,直到達到零,掃描變焦可以提供無限的放大倍數。然而:像在普通顯微鏡目鏡的放大倍率,也有定義,當掃描變焦跨越有意義使用的地平線規則。這些規則取決於分辨能力和透鏡的倍率,並且每個維度記錄的像素數。用於成像,掃描變焦以上20倍很少需要。提高放大係數僅用於激光處理,例如漂白或光活化。

由於不同的製造商使用不同的場數,掃描變焦的絕對值沒有可比性。為了迷惑額外的運營商,有的甚至使用放大因素小於一。一個更明智的值將是實際使用的場數,隻是通過計算對角線的掃描區域和由物鏡的倍率乘以此。根據這樣的指標,它甚至有可能以比較在不同的光學倍率性能(不同的物鏡)。

當未掃描的全部(光)場,一個人可以自由選擇該字段的部分被掃描。此功能被稱為“淘選”,並且需要掃描的編程偏移,即掃描儀不對稱地操作。這僅適用於閉環掃描儀。共振掃描儀需要不同的解決方案平移。

徠卡TCS SP8和TCS SP8 STED 3X使用幅度控製縮放和掃描偏移量平移。變焦控製掃描場大小,應當標明作為場數FN的變化。

圖2:上:視的光電場被完全使用由方形掃描,涉及的中間像場的限製。 的大小對應於對角線方(相同與圓形場(虛線圓),這是通常表示為字段號FN的直徑,典型地,最大的掃描區域是稍微低於光電場數,因此AG亚游集团將稱之為它的FN 0將它與縮放掃描進行比較。 
中間:如果掃描幅度被減小,例如,通過3倍於兩個維度,那麽使用的字段也是原始場直徑的1/3。 光學分辨率保持不變,掃描分辨率增加,因為是有效放大。 這個操作類似於一個3倍變焦相對於原始字段(1×放大)。 為適當的比較,這應顯示在FN方麵,這裏FN = FN 0/3。 
底部:當放大掃描開始從中點,被掃描區域可在光學領域內移動。 這被稱為泛函數(淘選)。


如何糾正假動作

如前所述,限速元素時掃描是x振鏡。如果有需要的折回沒有空閑時間,並且將掃描儀可以在一個完美鋸齒操作,則每個象素的時間將是1 / F *的x,以f為掃描頻率和x的像素的數目。即時掃描儀,這是不完全達到,作為回縮時間是有限的,並且機械伸長的“端部”被切斷,因為它們表現出非線性。在較高速度下,可編程掃描儀以正弦模式,這是當然也可以為低速,操作。 共振掃描儀隻能掃描正弦。

如果掃描正弦,那麽時空關係不再是線性的。作為圖像失真是不能接受的,則強度必須在x和y等距離記錄中,對應於inequidistant記錄時間。 因此,數據記錄(像素)的在一條線上的開始時間是在將掃描器動作更快,並且相距較遠的線的端部的線的中間致密,作為掃描速度為零時結束,並開始移動在相反的方向。 甲不完全合適,但有可能解決這一問題的辦法是使用正弦,這大約是線性的唯一的正中央。但一會損失90%的可用的掃描時間(而激光是在所有的時間),將需要在更廣泛的振幅,這反過來會減慢電流計掃描器進行掃描。因此,人們采用了較大部分,如80%的一種列車(在雙向模式下工作時它給出60%的時間周期),並施加一個非線性像素時鍾。該非線性像素時鍾很容易與閉環掃描儀獲得的,因為它們提供使用位置外用進行解碼。非線性像素倍的第二個效果是,每個象素的記錄時間也是位置依賴性。如果一個采用標準電荷放大器強度電流變換中,像素會在邊緣處明亮。此外,相對於掃描中心的噪聲較少的邊緣。對於正常的成像,這不是一個問題。噪聲依賴性的方法,如光柵圖像的相關性,將遭受這樣的記錄,因為噪聲是高短像素和下在長的像素。 這裏,人們必須確保在整個掃描區域(這是在最大的最短像素的中心的長度)恒定的積分時間。 高頻采樣和intrapixel積累如在共聚焦顯微鏡與Leica TCS SP5引入允許每個像素獨立的位置和速度的積分時間的控製。

圖3:左:具有均勻象素時鍾dt的掃描正弦和記錄數據時,該信號將被從非等距離的點樣品中抽出,因此,圖像會被扭曲。 在該中心,圖像將由於掃描儀(:DSç每次距離)的更快的速度擴大。 (:雙鏈ê每個時間距離)的邊緣時,圖像將由於掃描器的低速擠壓。 
右:為了獲得在空間上等距點的ds數據,象素時鍾必須被編程為較長的時間在邊緣(DT E)和更短的時間在中心(dt的C)。


一行人的解決方案:使用倫奇光柵和光斬

共振掃描儀不可編程的速度和掃描偏移,缺乏精確的位置讀出。仍然采用共振掃描儀與效益,這些缺點需要進行補償。使用光學標尺第一可行的解決方案作為一個采樣時鍾是在1995年在波利的共焦手冊描述R.錢學森。這種方法利用一個第二,低功率的紅色激光引導至後方的掃描鏡作為位置探針(也反射)側。反射探測光穿過一個光柵,它由透明和非透明條紋(光柵的Ronchi),很像一個柵欄。探測光上掃描光柵和光由光電二極管檢測到之後。由於柵欄是等距和掃描儀運動正弦調製的探測光施加亮暗圖形與正弦波脈衝長度。這些圖案的側麵可以用作一個像素時鍾,然後將其正弦時刻,但等距離在掃描場空間。

盡管這個概念解決了非線性像素時鍾的問題,它有其局限性。像素的最大數量是由光柵網格元件的數量排除。像素的數量可能僅在圍欄板條的數目的整數部分進行切換。

可用的縮放因子取決於適當的光柵的可用性:提高放大係數要求同等像素數較短(和密集)光柵。因此,沒有辦法連續的縮放和開關變焦時,人們必須改變光柵的探測光束路徑。因此,一組光柵必須是一個光柵存儲庫中可用-通常是一可旋轉的圓盤。

平移不可用這種機械參考測量。

  • 光機的像素時鍾產生使用倫奇光柵諧振掃描儀 

圖4:左:用光學機械像素時鍾解碼共振掃描共聚焦的示意圖。 用於成像,激光通過分束鏡射向掃描鏡和激勵熒光的樣品(藍色跡線)。 所發射的光(綠色跡線)由掃描鏡退掃描,由分束反射鏡反射,並轉換成由所述檢測器的電信號。 輔助激光被引導到掃描鏡(紅色跡線)的後側(也反射)。 它傳遞一個象素光柵,它導致從檢測光電二極管的二進製信號I 第 
右:提取的一組像素時鍾通過跟蹤探測光束(在掃描反射鏡的背麵反射,X')上組成的不透明和透明的等距條紋的固定數量的格。 傳感器將產生的強度信號I P,然後轉換成像素觸發脈衝噸PIX。


一個聰明的解決方案:使用鎖定並提取整個運動

AG亚游集团如何可以設計為共振掃描儀的控製,允許任何數量的像素都連續的縮放和選擇至最高?和單向或雙向掃描在用戶的請求?一個穩定和精確的解決方案引入徠卡的TCS SP2在2000年這個概念已經被係統中的應用與徠卡共振掃描儀。

共振振鏡掃描儀是扭轉諧振蕩器。他們旋轉振蕩諧波運動。因此,他們的運動模式是嚴格的正弦函數。所有AG亚游集团需要做的是測量運動掃描儀的實際相位和振幅,並將其與激勵信號。測量是通過一個紅外二極管照射到掃描鏡的後表麵進行。 為了檢測信號,一個位置敏感裝置(PSD)的采用。這是一種無定形的,因此連續測量裝置,不像一個光柵,其具有元件的預定數量(限製了測量的分辨率)。 從這一點,AG亚游集团可以提取精確的幅度和相位通過一個鎖定方法,該方法允許AG亚游集团創建一個合成正弦函數類似鏡子的真實運動。這是可能的,因為諧振電流計的Q值在1000的範圍內。這意味著,該係統總是振蕩正弦在諧振頻率 - 的偏差小於0.1%時,即使激發通過一個方波。諧振頻率取決於溫度等環境參數,但AG亚游集团測量頻率,AG亚游集团可以肯定在最佳頻率操作掃描器。 這種方法不依賴於光柵的準確性,也沒有對調整和更換,例如格柵或其他機械或光學輔助工具。由高品質的測量幅度和振蕩器的相位,AG亚游集团有反射鏡的在任何時候都在位置的非常精確的知識。

現在隨時知道樣品中的點的位置,AG亚游集团就可以檢測到的信號分配到在x和y(和z)的空間坐標。 們可以自由地分解檢測強度的列車(AG亚游集团用一個高頻取樣連續測量),在任何數目的像素。即:如果像素的最大數目是每行如1000中,AG亚游集团可以從理論上要求1和1000之間的任何掃描格式。

此外,AG亚游集团可以決定使用所有所測量的信號,其對應於較長的像素倍的X掃描的邊緣。或者,以保證相等性質來測量高階矩像的強度進行相關研究的方差,AG亚游集团可以限製該像素長度為恒定所有沿x掃描。

正如AG亚游集团測量和控製的幅度,就可以連續地改變的字段的大小。即:連續的縮放,這是具有機械格引用是不可能的。

如果AG亚游集团要移動縮放區域在視顯微鏡的領域,AG亚游集团可以掛載共振掃描儀可旋轉的裝置,它允許添加的機械(此處:X方向)抵消。該位置敏感的裝置和振蕩特性與鎖定係統的提取仍然這些條件,這允許AG亚游集团使用與諧振掃描泛函數,太下工作。

  • 位置敏感的基於二極管的非線性像素時鍾發生器可調變焦和可自由調節格式。實現了徠卡TCS SP5和徠卡TCS SP8共聚焦和多掃描顯微鏡。也可用於TCS SP8 STED和STED 3X儀器。

圖5:左:一個共振掃描共聚焦與鎖定像素時鍾解碼示意圖。用於成像的激光通過一個可編程光聲分光器射向掃描鏡和激勵熒光的樣品(藍色跡線)。 所發射的光(綠色跡線)由掃描鏡退掃描,由AOBS傳送並轉換成由所述檢測器的電信號。輔助IR二極管被定向到的掃描鏡(紅色跡線)的後側(也反射)。它到達一個位置敏感裝置(PSD),它提供了可重現的掃描鏡的全部運動的信號。 
右:位置控製的可調像素時鍾與共振掃描儀的框圖。反射鏡的運動由位置敏感裝置(PSD),其饋入一個鎖定放大器監測。在這裏,在幅度和相位方麵的實際運動(動作)與激勵信號(額定值)進行比較。基於DSP的控製器調整從優化運行任何偏差,並提供正確的參數,以像素時鍾模塊。這裏,從顯微鏡的發射信號被分成在空間上等距離的段(像素時鍾)。 每像素的實際積分時間也可控製,並且可以覆蓋整個像素的時間(不相等長邊緣處與中心),或修剪像素積分時間在時間上等距測量。




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